【佳學基因檢測】易栓癥基因檢測：一個家庭受益的案例

資深臨床醫(yī)師如何看待易栓癥基因檢測？

血栓癥就是高血栓形成傾向。血栓形成傾向是一種多因素疾病，涉及環(huán)境因素和遺傳因素。通過基因解碼所明確的導致血栓形成傾向相關(guān)先天性疾病傾向的因素包括抗凝血酶缺乏、蛋白C和蛋白S缺乏、凝血因子V Leiden突變、凝血酶原異常和抗磷脂綜合征。心血管疾病致病基因鑒定基因解碼揭示了在中國的一個家庭中，編碼凝血因子II（即凝血酶）的F2基因突變與血栓形成傾向風險之間的關(guān)聯(lián)，該家庭中有四名成員（I-2、II-2、II-3和III-1）有深靜脈血栓栓塞史。致病基因鑒定基因解碼通過實驗室檢測和計算機斷層血管造影術(shù)對該家庭的疾病進行了評估。為了確定導致血栓形成傾向風險增加的基因原因及該病的遺傳力，采用全外顯子組測序技術(shù)對兩名患者（II-2和III-1）進行了分析。在兩名受影響個體中分別觀察到的2222和2203個遺傳變異中，經(jīng)篩選和Sanger測序確認后，發(fā)現(xiàn)了一種外顯子錯義F2突變T165M（NM_000506:c.C494T:p.T165M;rs5896）。I-2、II-3和III-1與先證者（患者II-2）都具有這一突變，而II-6則為該突變的雜合子形式。在正常對照組中未檢測到這種有害突變。本基因檢測項目明確了家族成員患病的共同原因，結(jié)合生相關(guān)生育技術(shù)可以阻斷該病在家族中的傳播。

易栓癥的基因解碼

易栓癥是高度血栓形成傾向?；蚪獯a揭示其是一種血液凝固障礙，以易于形成血栓為特點，并導致不良血栓事件的風險增加，包括深靜脈血栓栓塞（DVT）和肺栓塞（PE）。血栓形成傾向的風險因素包括遺傳和環(huán)境原因。已有的基因解碼表明，血栓形成傾向是由蛋白質(zhì)分化或功能缺陷引起的，包括蛋白質(zhì)C和S的缺乏，以及已確定的約8種人類基因突變作為致病原因。然而，血栓形成傾向的遺傳原因在基因解碼的基礎(chǔ)上得以進一 步增加。一名52歲的漢族男性因反復性DVT被轉(zhuǎn)診至佳學基因合作醫(yī)療機構(gòu)，其新穎因DVT住院發(fā)生在2001年。經(jīng)過治療后，患者康復。2003年，該患者因PE再次入院，并在人民醫(yī)院置入下腔靜脈濾器以防止進一步的PE。通過實驗室檢測和計算機斷層掃描（CT）血管造影術(shù)，患者的疾病被診斷為血栓癥。分析了可能參與其疾病發(fā)生的因素。為了調(diào)查可能的潛在原因，采用了全外顯子組測序（WES）技術(shù)及基因解碼來排除疾病發(fā)生的基因原因，并鑒定出F2基因的突變。未檢測到凝血因子V Leiden突變或凝血酶原G20210A突變。

F2基因位于染色體區(qū)域11p11-q12，跨越20.3kb。該基因轉(zhuǎn)錄并翻譯成凝血因子II，即凝血酶（462個氨基酸），它參與人類血液凝固的賊后階段并控制凝血酶原的合成。F2突變導致各種形式的血栓形成和凝血酶原異常。

佳學基因檢測在患病家族的同意下，招募了一個患有血栓形成傾向的漢族家庭。該家庭包括11名健在成員（包括先證者及受影響個體II-3、III-1），并選取了100名正常的漢族獻血者作為對照。正常獻血者的年齡范圍（35至60歲）和性別比例（50名男性，50名女性）與患有該疾病的II-2、II-3、III-1患者的選擇相匹配，且他們的年齡分別為52歲、50歲和32歲。血栓形成傾向的診斷基于典型的臨床和實驗室測量結(jié)果，并通過CT血管造影術(shù)（CTA）進行確認。從所有研究參與者中采集抗凝管中的外周血，并按照標準程序，使用酚-氯仿法從家庭成員和正常獻血者的白細胞中提取基因組DNA。

圖１：受試者的計算機斷層掃描血管造影圖像。箭頭表示下腔靜脈濾器。

全外顯子組測序（全外顯子測序）

利用全外顯子組測序（WES）技術(shù)對先證者及其兒子（III-1）的DNA進行測序。對約26,000個蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子進行測序，同時對具有血栓癥（血檢形成傾向）患者和健康個體的基因突變序列進行比對。使用NimbleGen SeqCap EZ Human Exome Library v2.0試劑盒（Roche Diagnostics，美國印第安納波利斯）捕獲每個樣本的編碼序列，并將每個捕獲的文庫加載到Solexa Hiseq2000平臺（Illumina，美國圣地亞哥）上進行序列分析。使用Covaris S2系統(tǒng)（Covaris Inc.，美國馬薩諸塞州沃本市）對兩名受影響個體的基因組DNA樣本進行片段化。然后將DNA Library Prep Reagent Set（New England Biolabs Inc.，美國）中的接頭連接到所得片段的兩端。通過連接介導的聚合酶鏈反應（PCR）擴增捕獲的片段，隨后進行測序。
 

突變序列定位與基因解碼分析

參與者的全外顯子組測序（WES）是從血液中提取的基因組DNA進行的，并通過佳學基因高通量基因測序及基因解碼平對啊進行分析。使用Burrows-Wheeler Aligner將所有的測序的區(qū)域定位到與人類參考基因組。使用SOAPsnp軟件包和SOAP denovo分別檢測合并BAM文件中的單核苷酸多態(tài)性（SNP）以及插入或缺失（indels）。（http://www.soap.genomics.org.cn/soapsnp.html）。

候選SNP的篩選與標記

使用以下分析參數(shù)對候選SNP進行篩選和標記：i) SNP質(zhì)量得分大于20；ii) 測序深度不低于4倍；iii) 兩個SNP之間的距離大于5個堿基對；iv) 估計的拷貝數(shù)小于2。

圖2：先證者的計算機斷層掃描血管造影圖像顯示了肝硬化和脾腫大。（紅色箭頭指示先證者的肝腫塊，白色箭頭指示脾臟）。

候選基因驗證

候選突變通過高通量測序獲得后，佳學基因進一步采用諾貝爾獲獎技術(shù)Sanger測序驗證WES的高效性，以確認候選基因的突變。使用的PCR引物為正向5′-TGTGAACATCACCCGGTCAG-3′和反向5′-GACTGACGCCAGCTCTGAAG-3′，設計用于驗證T165M基因中的候選突變。結(jié)果與WES識別的候選突變一致。此外，還通過以下方法驗證了WES結(jié)果的高效性：i) 家族內(nèi)驗證，在每個家庭成員的基因組中觀察到表型和基因型的共分離突變；ii) 在100名正常獻血者中進行驗證，確認在正常獻血者中未觀察到表型和基因型的共分離突變。此外，使用ClustalW2（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）對凝血因子II的跨物種氨基酸進行了比較。從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取F2的氨基酸序列，然后輸入到ClustalW2中。ClustalW2的結(jié)果顯示了所選序列的賊合適匹配，并以一種易于識別和理解的方式對齊了它們的同一性、相似性和差異性。

基因解碼結(jié)果找到了家族中血栓傾向患者的臨床特征

已知增加血栓事件發(fā)生風險的遺傳因素包括蛋白C和蛋白S缺乏。此外，因子V Leiden和凝血酶原G20210A突變、因子VIII、IX或XI水平升高、同型半胱氨酸和纖維蛋白原也可能是血栓事件的危險因素。通過佳學基因合作醫(yī)院的實驗室檢測和CT血管造影，證實了患者的易栓癥的臨床診斷。分別采用酶聯(lián)免疫吸附試驗、一期凝血試驗和單克隆抗因子XI捕獲抗體測定因子VIII、IX和XI的水平。采用多克隆酶聯(lián)免疫吸附試驗測定蛋白C和蛋白S，采用STAGO自動凝血儀進行凝血研究?；颊叩哪蜃蛹暗鞍證和S水平均正常。然而，先證者及其他受累家族成員的纖維蛋白原水平異常。觀察到他們的活化部分凝血活酶時間和血漿凝血酶原時間延長。血漿免疫反應性纖維蛋白原水平也較低。
 

全外顯子組測序確定F2為候選基因

對先證者及其兒子（II-2和III-1）的外顯子組進行了捕獲和測序。按照之前描述的測序和過濾步驟后，為兩名受累個體確定了候選變異體。總體而言，外顯子組實現(xiàn)了高覆蓋率，為兩名受累個體分別產(chǎn)生了9300萬和9900萬條測序讀段，分別覆蓋了73億和74億個堿基。其中，約90.7%的讀段與人類參考基因組比對成功，60.5%的讀段落在靶向和富集的外顯子上。靶向外顯子的平均測序深度為84倍。在該家族的兩名受累個體中，分別鑒定出101,037和97,227個遺傳變異，包括非同義突變、剪接受體和剪接供體位點變異以及插入/缺失（indels）。此外，這些II-2和III-1的變異體還通過美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）dbSNP構(gòu)建版132（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）、SIFT（http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html.）和PolyPhen2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）進行了進一步評估。SIFT和PolyPhen2程序用于蛋白質(zhì)分析，其應用過程符合之前描述的分析方案。經(jīng)過這一過濾步驟后，僅在候選區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個變異體（NM_000506:c.C494T:p.T165M;rs5896）。該變異體是一個之前在其他漢族人群研究中未被觀察到的純合子錯義突變，但在新疆哈薩克族人群中，該變異體被報道為與血栓傾向相關(guān)的遺傳風險因素。

Sanger測序

為了驗證全外顯子組測序（WES）的結(jié)果，采用Sanger測序分析了該家族中F2基因的候選突變（T165M）。結(jié)果顯示，Sanger測序進一步證實了候選變異體（T165M）的存在，排除了假陽性的可能性。多方法驗證，高效了檢測結(jié)果的正確性。

圖3： 一個患有血栓傾向（thrombophilia）的家族的家系圖

T165M的為什么是致病基因？基因解碼進一步明確

根據(jù)《人體致病基因集及其結(jié)構(gòu)功能分析》，F(xiàn)2的結(jié)構(gòu)與人類凝血酶原相似。受影響的氨基酸（T165M）位于第6外顯子，導致第165位氨基酸由蘇氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?。先前的研究已揭示，?外顯子及其側(cè)翼區(qū)域具有高度多態(tài)性。然而，通過ClustalW2將受影響的人、小鼠、猩猩、兔子、大鼠、牛、綿羊、馬、豬、熱帶爪蟾和黑猩猩基因組中的氨基酸序列及其側(cè)翼區(qū)域（殘基145-185）進行比對，發(fā)現(xiàn)T165M位于F2的一個高度保守區(qū)域內(nèi)。進一步說明該基因序列的正常對健康維護的重要性。

易栓癥基因檢測的重要意義

在易栓癥的致病基因查找及其遺傳性的分析判定中，采用CT血管造影和臨床試驗對家族內(nèi)的血栓傾向進行了診斷。CT血管造影已成為評估深靜脈血栓形成（DVT）和肺栓塞（PE）的有用診斷成像方法，且比其他成像方式更為有效，特別是對于縱隔和實質(zhì)結(jié)構(gòu)的評估。能夠可視化先證者體內(nèi)下腔靜脈濾器的位置、脾腫大和肝硬化。實驗室測量結(jié)果可能表明該家族血栓傾向風險增加的根本原因。值得注意的是，在先證者中未檢測到因子V Leiden和凝血酶原G20210A突變。潛在原因可能是血液凝固成分異常，這可能影響凝血酶介導的機制以及凝血和抗凝過程。

易栓癥致病基因鑒定基因解碼利用全外顯子組測序（WES）技術(shù)發(fā)現(xiàn)了這一家庭可能的F2變異體與血栓傾向潛在分子機制之間的關(guān)聯(lián)，并揭示T165M突變是疾病發(fā)生的原因，其遺傳性遵循孟德爾遺傳規(guī)律。基因解碼進一步明確，如果家族成員是變異的雜合子基因型不會形成血栓癥，而純合子具有血栓形成高風險。