【佳學基因檢測】結(jié)直腸癌基因檢測明確患者癌癥的與眾不同

腫瘤基因解碼基因檢測如何增加檢測的準確性？

腫瘤基因解碼發(fā)現(xiàn)RNF43基因的功能缺失突變通過穩(wěn)定Frizzled受體而誘導Wnt配體依賴的Wnt/β-catenin信號通路的激活,這種情況常見于由齒狀息肉腺瘤發(fā)展而來的微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)型結(jié)直腸癌(結(jié)直腸癌(CRC))中。然而,RNF43突變?nèi)绾未龠M腫瘤發(fā)生的機制對基于數(shù)據(jù)庫比對的基因檢測來說還不清楚。在腫瘤致病基因鑒定基因解碼中,結(jié)直腸癌基因檢測建立了9個人類結(jié)直腸癌(CRC)來源的類器官,發(fā)現(xiàn)其中3個類器官系攜帶與MSI-高和BRAF V600E突變相關的RNF43移碼突變,表明這些結(jié)直腸癌(CRC)是通過鋸齒狀通路發(fā)展而來的。RNF43移碼突變的類器官需要Wnt配體和R-spondin來增殖,這表明R-spondin對ZNRF3的抑制和保留的RNF43功能是實現(xiàn)腫瘤發(fā)生所需的不可或缺的Wnt激活水平的必要條件。然而,RNF43突變類器官中的活性β-catenin水平低于APC雙擊突變的結(jié)直腸癌(CRC),這表明通過鋸齒狀通路發(fā)展的結(jié)直腸癌(CRC)具有較低的Wnt激活閾值。有趣的是,將RNF43突變的類器官與腸道肌成纖維細胞一起移植加速了異種移植瘤中β-catenin的核積累和增殖,表明基質(zhì)細胞在促進RNF43突變結(jié)直腸癌(CRC)細胞的惡性表型中起關鍵作用。對亞克隆類器官細胞表達轉(zhuǎn)錄本的測序顯示,兩個類器官系攜帶單等位基因RNF43順式突變,即兩個RNF43移碼突變引入同一等位基因而野生型RNF43等位基因保留,而另一個類器官系攜帶雙等位基因RNF43反式突變。這些結(jié)果表明,雜合RNF43移碼突變通過鋸齒狀通路促進結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)展;然而,與單擊突變相比,第二次RNF43突變可能通過進一步激活Wnt信號而在腫瘤發(fā)生中更具優(yōu)勢。最后,PORCN抑制劑治療顯著抑制了RNF43突變細胞來源的PDX腫瘤發(fā)展。這些結(jié)果揭示了RNF43突變相關結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)展的新機制,以及Wnt配體抑制對RNF43突變結(jié)直腸癌(CRC)的治療潛力。

結(jié)直腸癌基因檢測明確患者癌癥的與眾不同關鍵詞

RNF43、鋸齒狀通路、結(jié)直腸癌、類器官、Wnt配體、PORCN抑制劑

腫瘤基因解碼為什么要關注結(jié)直腸癌基因檢測的全面性？

Wnt信號通路在成體組織干細胞的維持中起作用，這一過程由破壞復合物調(diào)控，其中GSK3磷酸化β-catenin，導致β-catenin通過泛素-蛋白酶體途徑降解。Wnt信號也在受體水平受到調(diào)控；即E3連接酶RNF43和ZNRF3通過泛素化Wnt受體Frizzled（FZD）來下調(diào)Wnt信號，導致其周轉(zhuǎn)。小鼠遺傳學腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼表明，同時破壞腸道中的Rnf43和Znrf3會導致Wnt配體獨立生長和通過Wnt信號激活發(fā)展成腸道腫瘤。

與此一致，在約18%的結(jié)直腸癌（結(jié)直腸癌(CRC)）病例中發(fā)現(xiàn)了RNF43的遺傳改變。RNF43突變也在卵巢、胃和胰腺癌中被發(fā)現(xiàn)。在遺傳性鋸齒狀息肉病中，發(fā)現(xiàn)了RNF43的胚系突變，并且通過雜合性丟失（LOH）的第二次打擊失活也在腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。此外，在卵巢癌中也報道了野生型RNF43的丟失。這些結(jié)果表明RNF43的雙擊突變在促進腫瘤發(fā)生中起作用。

鋸齒狀腸腺瘤被認為是結(jié)直腸癌(CRC)的前體病變。值得注意的是，齒狀腺瘤和鋸齒狀通路型結(jié)直腸癌(CRC)中的RNF43突變與BRAF V600E突變和CpG島甲基化表型（CIMP）相關，導致MLH1啟動子的甲基化，這進一步引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI），而不需要DNA錯配修復基因突變。此外，在胃、食道和子宮內(nèi)膜的MSI癌癥中也檢測到RNF43突變，表明RNF43突變是MSI型癌癥的主要驅(qū)動因素。更進一步，在Rnf43 -/- 小鼠中，結(jié)腸炎相關的結(jié)腸腫瘤發(fā)展加速，使用Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子的體內(nèi)篩選確定Rnf43是腸道腫瘤發(fā)生的候選驅(qū)動因子。綜合這些結(jié)果表明，由RNF43功能障礙引起的FZD受體水平增加通過Wnt信號激活驅(qū)動腸道腫瘤發(fā)生，特別是在通過鋸齒狀通路發(fā)展的MSI-結(jié)直腸癌(CRC)中。Wnt被棕櫚酰化O-?；?a href='http://touyanshe.cn/cp/chabiyin/cancer/2024/77267.html' target='_blank'>轉(zhuǎn)移酶（PORCN）棕櫚酰化，這對Wnt分泌是必需的，PORCN抑制劑抑制了RNF43突變結(jié)直腸癌(CRC)細胞的生長。與此一致，轉(zhuǎn)化腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼表明PORCN抑制是針對Wnt配體依賴性癌癥的有效治療策略。

最近的腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼已經(jīng)確定了RNF43突變類型與其致瘤潛力之間的聯(lián)系。然而，關于RNF43突變的遺傳信息仍不足以理解結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)展的機制。此外，已經(jīng)顯示37%的Wnt配體依賴性胰腺癌細胞需要外源性Wnt配體，而其他細胞利用內(nèi)源性Wnt配體。這種細胞類型差異在結(jié)直腸癌(CRC)中尚未得到很好的表征。

在本腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼中，結(jié)直腸癌基因檢測建立了人類結(jié)直腸癌(CRC)來源的類器官，并在CIMP-高/MSI-高結(jié)直腸癌(CRC)中發(fā)現(xiàn)了RNF43移碼突變。重要的是，RNF43突變的類器官依賴于內(nèi)源性或外源性Wnt配體，PORCN抑制劑顯著抑制了類器官增殖和異種移植瘤發(fā)生。此外，對亞克隆細胞來源轉(zhuǎn)錄本的測序表明，雜合單等位基因RNF43突變驅(qū)動結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)展，而第二次打擊突變可能對腫瘤發(fā)生有利。

如何進行腫瘤致病基因鑒定基因解碼？

全外顯子組測序

使用原始類器官細胞（非亞克隆）進行全外顯子組測序。使用NucleoSpin Tissue XS（Macherey-Nagel，杜倫，德國）提取基因組DNA。使用SureSelect Human All Exon V6試劑盒（Agilent，弗里蒙特，加利福尼亞州，美國）制備雙端文庫，并使用Illumina NovaSeq 6000進行測序（外包給Takara Bio，草津，日本）。生成的fastq文件使用DRAGEN Bio-IT平臺（Illumina，圣迭戈，加利福尼亞州，美國）映射到人類參考基因組版本GRCh37（hg19）上。檢查了APC、CTNNB1、RNF43、ZNRF3、KRAS、BRAF、TGFBR2、ACVR2A和TP53基因中的移碼突變、無義突變和已報道的致癌突變。

CIMP分析

使用EpiTect Bisulfite試劑盒（Qiagen，希爾登，德國）對基因組DNA進行亞硫酸氫鈉修飾。通過亞硫酸鹽焦磷酸測序分析經(jīng)典CIMP標記物（MINT1、MINT2、MINT31、MLH1和CDKN2A）和新CIMP標記物（CACNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3和SOCS1）的DNA甲基化水平，如先前所述。

MSI分析

提取基因組DNA，并根據(jù)修訂的貝塞斯達指南對兩個單核苷酸（BAT25和BAT26）和兩個雙核苷酸（D2S123和D5S346）微衛(wèi)星標記物（System Biotics，相模原，日本）進行MSI分析。如果這些標記物中有兩個或更多顯示不穩(wěn)定性，則將樣本診斷為MSI-高。

RNF43密碼子370的基因分型

使用TaqMan SNP基因分型檢測（Applied Biosystems，沃爾瑟姆，馬薩諸塞州，美國）檢查RNF43密碼子370的基因型。野生型RNF43密碼子370（VIC）和p.Rpo370fs（FAM）的TaqMan引物和探針序列在補充材料和方法中提供。使用Mx3000P（Stratagene，拉霍亞，加利福尼亞州，美國）的等位基因判別/SNP系統(tǒng)分析PCR結(jié)果。合成定制的RNF43 p.Pro370fs cDNA以獲得純合突變對照。

人類基因表達數(shù)據(jù)庫分析

從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫（https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）下載人類結(jié)直腸癌(CRC)表達數(shù)據(jù)。提取攜帶APC深度缺失（n = 19）或在密碼子659 N端的RNF43移碼突變（n = 12）的結(jié)直腸癌(CRC)表達數(shù)據(jù)，并使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）（Ingenuity Systems，Qiagen；www.ingenuity.com）檢查上游調(diào)節(jié)因子。Z-score ≥2且P值<0.05被認為表示具有統(tǒng)計學意義的激活。

腫瘤致病基因鑒定基因解碼如何增加結(jié)直腸癌致病及靶向藥物基因檢測的準確性？

腫瘤的致病基因鑒定基因解碼先前的工作已經(jīng)明確，具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）的鋸齒狀息肉更容易發(fā)展為結(jié)直腸癌（結(jié)直腸癌(CRC)）。RNF43突變常見于無蒂鋸齒狀病變（SSL）和MSI型結(jié)直腸癌(CRC)中，表明RNF43突變可能通過鋸齒狀途徑驅(qū)動結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)展。結(jié)直腸癌基因檢測的腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼發(fā)現(xiàn)，在CIMP高和MSI高的結(jié)直腸癌(CRC)衍生類器官中存在RNF43移碼突變，這些突變與BRAF V600E突變相關。

值得注意的是，RNF43突變型結(jié)直腸癌(CRC)中的活性β-catenin水平明顯低于APC雙擊突變結(jié)直腸癌(CRC)，且僅在APC突變型結(jié)直腸癌(CRC)中觀察到β-catenin的核積累。這表明鋸齒狀途徑腫瘤發(fā)生的Wnt激活閾值低于常規(guī)途徑。有腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼報道，與非超突變結(jié)直腸癌(CRC)相比，MSI高超突變結(jié)直腸癌(CRC)中的Wnt激活程度顯著降低。常規(guī)途徑中，高水平的Wnt激活可能是形成腺瘤性息肉所必需的初始事件，如在Apc Δ716基因敲除小鼠中觀察到的。盡管在Rnf43 −/− Znrf3 −/− 復合突變小鼠腸道中發(fā)現(xiàn)了腺瘤性增生，但在Rnf43 −/− 單突變小鼠中未觀察到此現(xiàn)象。這些結(jié)果暗示RNF43突變誘導的Wnt激活程度可能不足以啟動常規(guī)型結(jié)直腸癌(CRC)，但可以促進鋸齒狀途徑腫瘤發(fā)生。

腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼中，所有RNF43移碼突變結(jié)直腸癌(CRC)細胞均以R-spondin依賴的方式增殖。這表明可能需要通過R-spondin抑制ZNRF3功能并保留RNF43功能，才能達到RNF43突變細胞中腫瘤發(fā)生所需的Wnt信號水平。

先前腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼報道，卵巢腫瘤和鋸齒狀結(jié)腸腫瘤中存在導致野生型RNF43丟失的LOH或二次體細胞突變，這暗示RNF43可能需要兩次突變失活才能發(fā)生腫瘤。然而，結(jié)直腸癌基因檢測的結(jié)果顯示C14和C24細胞中存在雜合的單等位基因RNF43突變，表明RNF43的雙等位基因失活可能不是鋸齒狀通路腫瘤發(fā)展的必要條件。另一方面，結(jié)直腸癌基因檢測在C45細胞中發(fā)現(xiàn)RNF43存在兩次雙等位基因突變，這提示RNF43的兩次突變可能通過增加Wnt激活水平促進結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)展。此外，結(jié)直腸癌基因檢測還發(fā)現(xiàn)RNF43中p.Pro370fs和p.Gly659fs的順式突變位于同一等位基因。最近的分析表明，RNF43最常見的突變p.Gly659fs會輕微損害RNF43功能，而N端截斷突變在增加Wnt信號活性方面比C端突變更有效。因此，p.Gly659fs突變可能在C14和C24腫瘤發(fā)生的早期階段引入，導致Wnt信號略有增加。隨后在相同等位基因處引入另一個N端p.Pro370fs突變，可能通過進一步增加Wnt活性促進腫瘤的發(fā)生。

值得注意的是，將RNF43移碼突變結(jié)直腸癌(CRC)細胞與肌成纖維細胞共移植可增加β-catenin核積累和PDX腫瘤細胞增殖，表明RNF43突變細胞的惡性表型高度依賴于基質(zhì)細胞。多項腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼已證實Wnt信號在轉(zhuǎn)移中的作用：Wnt激活通過增加核Smai2表達促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，而β-catenin和FOXO3的核積累則加速結(jié)腸癌細胞的肝轉(zhuǎn)移。因此，轉(zhuǎn)移性微環(huán)境細胞可能通過激活Wnt信號在播散性RNF43突變結(jié)直腸癌(CRC)細胞增殖中發(fā)揮關鍵作用。本腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼證明ETC-159治療可顯著抑制RNF43突變PDX腫瘤。因此，進一步腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼PORCN抑制劑是否可以抑制RNF43突變細胞轉(zhuǎn)移灶的發(fā)展對未來臨床策略具有重要意義。

總之，結(jié)直腸癌基因檢測建立了RNF43移碼結(jié)直腸癌(CRC)衍生的類器官。腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼發(fā)現(xiàn)，RNF43突變鋸齒狀通路結(jié)直腸癌(CRC)的Wnt/β-catenin活化水平低于常規(guī)通路型結(jié)直腸癌(CRC)。雜合RNF43移碼突變可能通過鋸齒狀通路促進腫瘤發(fā)生，而二次RNF43突變可能通過增加Wnt活化水平進一步促進結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)展。最后，PORCN抑制顯著抑制了RNF43突變結(jié)直腸癌(CRC)細胞的PDX腫瘤發(fā)展，表明PORCN抑制劑可能是針對RNF43突變結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)展和轉(zhuǎn)移的有效治療策略。

以基因解碼為基礎的腫瘤遺傳性及靶向藥物基因檢測具有什么樣的特點？

基因解碼為基礎的腫瘤遺傳性及靶向藥物基因檢測增加結(jié)直腸癌致病及靶向藥物基因檢測的準確性和全面性，主要是從以下幾個方面考慮:

擴大基因檢測范圍:

除了傳統(tǒng)的APC、KRAS、BRAF等基因外，還應包括:

RNF43、ZNRF3等Wnt信號通路相關基因

MLH1、MSH2等錯配修復基因

CIMP相關標記基因如CACNA1G、IGF2等

新發(fā)現(xiàn)的驅(qū)動基因如TGFBR2、ACVR2A等

采用多組學檢測方法:

全外顯子組測序:檢測編碼區(qū)突變

全基因組測序:檢測大片段缺失、重排等

RNA測序:檢測基因融合和表達異常

甲基化測序:檢測CIMP狀態(tài)

蛋白質(zhì)組學:檢測蛋白功能異常

提高檢測靈敏度:

使用高深度測序

采用數(shù)字PCR等高靈敏度技術

液體活檢ctDNA檢測

關注基因突變的具體類型和位置:

區(qū)分激活突變和失活突變

注意突變的功能域位置

分析突變的等位基因狀態(tài)(雜合/純合)

建立綜合評分系統(tǒng):

整合多個基因的突變情況

考慮基因間的相互作用

納入臨床病理特征

開發(fā)人工智能算法:

機器學習模型預測致病性

深度學習分析復雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡

建立大規(guī)模數(shù)據(jù)庫:

收集更多患者樣本數(shù)據(jù)

整合多中心研究結(jié)果

定期更新數(shù)據(jù)庫

重視功能驗證:

體外細胞實驗驗證基因功能

動物模型驗證致病機制

臨床試驗驗證靶向藥物效果

關注腫瘤異質(zhì)性:

多區(qū)域取樣

單細胞測序分析

動態(tài)監(jiān)測腫瘤進展

結(jié)合臨床信息:

分析基因型-表型相關性

考慮患者個體差異

納入治療反應和預后信息

通過以上方法,可以更全面、準確地鑒定結(jié)直腸癌致病基因和靶向藥物靶點,為精準醫(yī)療提供有