【佳學(xué)基因檢測】一種利用下一代測序進(jìn)行差異甲基化基因座的基因檢測方法

高通量測序與甲基化基因檢測導(dǎo)讀

表觀遺傳變化，尤其是 CpG 基因座的 DNA 甲基化，對(duì)癌癥和其他復(fù)雜疾病具有重要意義。隨著下一代測序（NGS）的發(fā)展，使用病例對(duì)照設(shè)計(jì)生成數(shù)據(jù)以了解全基因組基因座甲基化狀態(tài)的差異是可行的。佳學(xué)基因解碼為此設(shè)計(jì)了適當(dāng)和有效的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，以解決這一基因檢測技術(shù)所遇到的困難。首先，與使用微陣列的甲基化實(shí)驗(yàn)不同，其中在特定 CpG 位點(diǎn)對(duì)一個(gè)個(gè)體進(jìn)行甲基化測量。佳學(xué)基因所采用的甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組有每個(gè)個(gè)體的甲基化等位基因和非甲基化等位基因的計(jì)數(shù)。其次，由于樣品制備的性質(zhì)，測量的甲基化反映了樣品制備中涉及的細(xì)胞混合物的甲基化狀態(tài)。所以，測量的甲基化水平的潛在分布是未知的，穩(wěn)健的測試比參數(shù)方法更可取。第三，目前高通量測序測量超過 200 萬個(gè) CpG 位點(diǎn)的甲基化。任何統(tǒng)計(jì)測試都必須具有計(jì)算效率，才能應(yīng)用于 NGS 數(shù)據(jù)?？紤]到這些挑戰(zhàn)，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組通過對(duì)甲基化計(jì)數(shù)進(jìn)行建模，提出了基于聚類數(shù)據(jù)分析的差異甲基化測試。甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組進(jìn)行了模擬以表明它在測量的甲基化水平的幾個(gè)分布下是穩(wěn)健的。它具有良好的功能并且計(jì)算效率很高。賊后，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組將該測試應(yīng)用于甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組關(guān)于慢性淋巴細(xì)胞白血病的高通量測序數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，這是一個(gè)很有前途和實(shí)用的測試。

高通量測序與甲基化基因檢測關(guān)鍵詞：

 DNA甲基化，甲基化差異檢測，二代測序

甲基化測序基因檢測科普介紹

近年來，由于基因分型技術(shù)的快速進(jìn)步和人類基因組計(jì)劃的完成，基因檢測關(guān)聯(lián)研究，尤其是大規(guī)模的全基因組基因檢測關(guān)聯(lián)研究變得非常流行。通過全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)確定了數(shù)百個(gè)疾病的易感基因座。盡管取得了這一進(jìn)展，并建立具有一定規(guī)模的數(shù)據(jù)庫。但迄今為止鑒定的遺傳變異僅解釋了大多數(shù)復(fù)雜疾病的一小部分表型變異 。表型變異的另一個(gè)潛在來源是表觀遺傳變化，例如 DNA 甲基化。

DNA甲基化是指在CpG二核苷酸中胞嘧啶的5'端添加一個(gè)甲基。啟動(dòng)子區(qū)域的 DNA 甲基化可以抑制基因的表達(dá)。已經(jīng)表明 DNA 甲基化變化與許多人類疾病有關(guān)，尤其是癌癥。CpG二核苷酸的高甲基化是腫瘤抑制基因失活的重要標(biāo)志。相反，正常甲基化基因的低甲基化可能導(dǎo)致癌基因的激活。基因解碼中的人類表觀基因組檢測是研究全基因組表觀遺傳模式 。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在可以通過下一代測序 (NGS) 對(duì)全基因組 CpG 位點(diǎn)獲得生成甲基化數(shù)據(jù)。在這些基因解碼過程中，DNA 樣本用亞硫酸氫鹽處理，它將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，并使甲基化的胞嘧啶保持完整。NGS 對(duì)每個(gè)受試者或樣品的每個(gè) CpG 位點(diǎn)處具有胞嘧啶（甲基化）的分子數(shù)和具有尿嘧啶（未甲基化）的分子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

基于來自高通量測序基因檢測的計(jì)數(shù)來測試組（例如，病例和對(duì)照）之間差異甲基化的一種簡單方法是對(duì)給定 CpG 位點(diǎn)的組內(nèi)受試者的計(jì)數(shù)求和，從而產(chǎn)生 2 × 2 列聯(lián)表（甲基化/未甲基化 × 病例/對(duì)照）。然后將 Pearson 的獨(dú)立性卡方檢驗(yàn)用于此表。這種方法是有問題的，因?yàn)槊總€(gè)個(gè)體的測序覆蓋率（測量的總分子數(shù)量較大）可能不同，導(dǎo)致測序覆蓋率大的個(gè)體對(duì)測試統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)產(chǎn)生不當(dāng)影響。此外，該測試沒有考慮甲基化水平的受試者間變異性。

另一種方法是首先估計(jì)每個(gè)個(gè)體每個(gè) CpG 位點(diǎn)的甲基化比例 ( β )， β = n methy / ( n methy + n unmethy )。然后可以對(duì)β應(yīng)用t檢驗(yàn)。這種方法消除了先前方法中覆蓋率不均的問題，并且該測試還考慮了甲基化水平的受試者間變異性。然而，這種方法存在幾個(gè)問題。首先，與甲基化微陣列實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)不同，在直接測量甲基化比例的情況下，甲基化比例是根據(jù)高通量測序的計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)估計(jì)的。測序覆蓋率的差異將導(dǎo)致β估計(jì)值的正確性不同，測序覆蓋率越大的受試者估計(jì)β的標(biāo)準(zhǔn)誤差越小。這種異方差性對(duì)于t檢驗(yàn)可能是有問題的。此外，t檢驗(yàn)的正態(tài)性假設(shè)可能不適用于高通量測序甲基化數(shù)據(jù)。除了測序覆蓋率的影響外，甲基化比例還可能受文庫制備、批次效應(yīng)等諸多因素的影響。這些附加因素會(huì)影響真實(shí)β在樣本或受試者上的分布，因此這種分布是未知的。因此，需要一個(gè)穩(wěn)健的t檢驗(yàn)替代方案。使用t檢驗(yàn)分析甲基化比例的另一個(gè)問題是t檢驗(yàn)定義在 -∞ 到 ∞ 之間，而甲基化比例限制在 0 和 1 之間。在實(shí)際數(shù)據(jù)中，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組觀察到相當(dāng)大比例的樣本和 CpG 位點(diǎn)具有甲基化比例等于 0 或 1。在本文中，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組提出了一種基于聚類數(shù)據(jù)分析的檢測差異甲基化 CpG 位點(diǎn)的測試，方法是直接對(duì)甲基化計(jì)數(shù)進(jìn)行建模。然后甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組進(jìn)行了模擬以表明所提出的測試在測量的甲基化水平的幾個(gè)分布下是穩(wěn)健的。

高通量測序甲基化測序的基因解碼方法

建立模型

在這里，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組在病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)中對(duì)甲基化計(jì)數(shù)進(jìn)行建模。假設(shè)案例組中有n A個(gè)人，對(duì)照組中有n U個(gè)人。甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組有k個(gè) CpG 位點(diǎn)的 NGS 全基因組甲基化數(shù)據(jù)。設(shè)m Aij是個(gè)體i在 CpG 位點(diǎn)j的甲基化讀數(shù)的計(jì)數(shù)，c Aij是個(gè)體i在 CpG 位點(diǎn)j的覆蓋率，β Aij是個(gè)體i在 CpG 位點(diǎn)j的真實(shí)甲基化水平情況下，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組對(duì)m進(jìn)行建模具有二項(xiàng)分布的Aij

m Aij ~ B ( c Aij ,  β Aij ),  i = 1, ... n A ,  j = 1, ... k。

(1)

類似地，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組將m Uij、c Uij和β Uij定義為控件中的對(duì)應(yīng)量，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組有

m Uij ~ B ( c Uij ,  β Uij ),  i = 1, ...,  n U ,  j = 1, ... k。

(2)

這里的關(guān)鍵是將高通量測序讀取視為每個(gè)個(gè)體中的集群，問題變成在存在集群數(shù)據(jù)的情況下比較兩個(gè)比例。這些集群是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的自然結(jié)果，也是對(duì)每組內(nèi)每個(gè)受試者測量的二項(xiàng)式數(shù)據(jù)的性質(zhì)。為此，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組采用了聚類數(shù)據(jù)分析的方法。這種方法首先計(jì)算設(shè)計(jì)效果，然后用于調(diào)整病例和對(duì)照中的甲基化比例。

模擬研究

在每種情況下，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組分別使用如上模擬的甲基化比例，根據(jù)方程 (1)和(2)模擬病例和對(duì)照的甲基化分子計(jì)數(shù)。甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組允許覆蓋率c Aij和c Uij通過從賊小為 5 的正態(tài)分布N (30, 13) 中采樣而變化，這是甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組在下面分析的實(shí)際數(shù)據(jù)中使用的賊小讀取次數(shù)。

結(jié)果

甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組在H 0下進(jìn)行了模擬，以研究所提出測試的 I 類錯(cuò)誤率。如上一節(jié)所述，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組考慮了甲基化水平分布的三種情況。對(duì)于每種情況，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組模擬了病例和對(duì)照中相同數(shù)量個(gè)體的甲基化計(jì)數(shù)。甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組將n A = n U設(shè)置為從 10 到 500 的不同數(shù)字，以研究樣本量的影響。在每個(gè)場景中，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組對(duì)每個(gè)樣本大小進(jìn)行了 100,000 次重復(fù)。表一給出了在場景 (a) 的幾個(gè)α水平上評(píng)估的經(jīng)驗(yàn) I 型錯(cuò)誤率，其中單個(gè)甲基化水平是從 β 分布產(chǎn)生的。相似地，表二給出場景 (b) 的經(jīng)驗(yàn) I 型錯(cuò)誤率，其中單個(gè)甲基化水平是從正態(tài)分布產(chǎn)生的，并且表三給出了場景 (c) 的經(jīng)驗(yàn) I 型錯(cuò)誤率，其中單個(gè)甲基化水平是從混合正態(tài)分布產(chǎn)生的。從這些表中可以看出，隨著樣本量的增加，I 類錯(cuò)誤率接近標(biāo)稱α水平。這適用于所有α水平和所有三種甲基化水平分布。與三種模擬情景相比，當(dāng)甲基化水平服從正態(tài)分布時(shí)，I 型錯(cuò)誤的膨脹低于甲基化水平服從 β 或混合正態(tài)分布的情景。當(dāng)甲基化水平遵循情景（c）中的混合物正態(tài)分布時(shí)，通貨膨脹賊高。

表一：模擬場景 (a) 的 I 類錯(cuò)誤率

表二：模擬場景 (b) 的 I 類錯(cuò)誤率

表三：模擬場景 (c) 的 I 類錯(cuò)誤率

相比之下，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組將t檢驗(yàn)和樸素列聯(lián)表方法應(yīng)用于H 0下的相同模擬數(shù)據(jù)集。類型 I 錯(cuò)誤率的結(jié)果在表一–III，分別用于模擬場景（a）、場景（b）和場景（c）。在所有三種模擬場景下，相對(duì)于建議的檢驗(yàn)， t檢驗(yàn)的 I 類錯(cuò)誤率都被夸大了。天真的列聯(lián)表方法的先進(jìn)類錯(cuò)誤率被進(jìn)一步夸大了。

因?yàn)樵O(shè)計(jì)效果將甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組提出的檢驗(yàn)與樸素檢驗(yàn)區(qū)分開來，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組在H 0下進(jìn)行了模擬，以探索可能影響設(shè)計(jì)效果大小的因素。在先進(jìn)組模擬中，單個(gè)測序覆蓋率是從具有 15 的恒定 SD 和不同平均值的正態(tài)分布生成的。從中可以看出圖1，設(shè)計(jì)效果隨著測序覆蓋率平均值的增加而增加，樣本量對(duì)設(shè)計(jì)效果沒有太大影響。在第二組模擬中，單個(gè)測序覆蓋率是從具有恒定平均值 30 和不同 SD 值的正態(tài)分布生成的。從中可以看出圖 2，設(shè)計(jì)效果隨著測序覆蓋率的可變性增加而增加，樣本量對(duì)設(shè)計(jì)效果的影響要小得多。這些結(jié)果表明，隨著測序覆蓋率的增加，需要對(duì)原始檢驗(yàn)進(jìn)行更大的校正，并且更大的樣本量不會(huì)降低設(shè)計(jì)效果。

圖1：具有不同測序覆蓋率平均值的模擬設(shè)計(jì)效果與樣本量的關(guān)系。

圖 2：不同測序覆蓋度 SD 的模擬設(shè)計(jì)效果與樣本量的關(guān)系。

甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組接下來在H A下進(jìn)行了模擬以研究所提出的檢驗(yàn)的功效，假設(shè)病例和對(duì)照中的甲基化水平來自具有不同平均值的分布。圖 3顯示了三種模擬場景在α = 0.0001 時(shí)評(píng)估的功率曲線。在圖中，效應(yīng)大小由 Cohen's d表示，并計(jì)算為平均差除以模擬中設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)偏差。如這些圖所示，所提出的檢驗(yàn)的功效隨著效果的大小而迅速增加。對(duì)比三種模擬場景，場景（a）和場景（b）的功率曲線幾乎相同，而場景（c）的功率與場景（a）和（b）相比有所降低。

圖 3：α = 0.0001時(shí)模擬的功率曲線。

接下來，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組分析了慢性淋巴細(xì)胞白血病 (CLL) 研究中的全基因組甲基化數(shù)據(jù)，這是一種主要發(fā)生在成人的 B 細(xì)胞淋巴瘤，是一種非常異質(zhì)的疾病。已知 Ig VH 基因內(nèi)的突變與癌癥的侵襲性有關(guān)，缺乏突變的患者預(yù)后較差。已知 CD38 水平與 Ig VH 突變狀態(tài)  和預(yù)后 相關(guān)，具有較低水平的患者進(jìn)展較慢。

減少代表性亞硫酸氫鹽測序 (RRBS)  用于測量 11 個(gè) CLL 樣品中的甲基化水平 。RRBS 技術(shù)提供對(duì)任何 CpG 位點(diǎn)進(jìn)行甲基化和未甲基化的 DNA 分子計(jì)數(shù)，這些位點(diǎn)通過典型運(yùn)行進(jìn)行測序，提供大約 200 萬個(gè) CpG 位點(diǎn)的數(shù)據(jù)。根據(jù) CD38 水平將樣本分類為低風(fēng)險(xiǎn)與高風(fēng)險(xiǎn)，其中 7 個(gè)樣本具有低 CD38 水平（低風(fēng)險(xiǎn)），4 個(gè)樣本具有高 CD38 水平（高風(fēng)險(xiǎn)）。甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組分析的 RRBS 數(shù)據(jù)已經(jīng)按照Pei 等人的描述進(jìn)行了清理和對(duì)齊。。

使用這種方法，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組獲得了 2,442,443 個(gè) CpG 位點(diǎn)的全基因組甲基化數(shù)據(jù)。所提議的檢驗(yàn)在高風(fēng)險(xiǎn)組中的設(shè)計(jì)效果平均值為 4.04 (SD = 7.88)。低風(fēng)險(xiǎn)組的設(shè)計(jì)效果平均值為 4.53 (SD = 12.59)。建議檢驗(yàn)的P值分布相對(duì)于均勻分布向更小的 P 值移動(dòng)，正如預(yù)期的那樣，如果一小部分 CpG 位點(diǎn)來自H A (圖 4）。為了比較，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組還通過首先從甲基化計(jì)數(shù)估計(jì)甲基化比例，然后對(duì)估計(jì)的甲基化比例進(jìn)行雙樣本t檢驗(yàn)，對(duì)數(shù)據(jù)集應(yīng)用t檢驗(yàn)方法。t檢驗(yàn)的P值分布(圖 5) 顯示了一種趨向于中等P值的模式，在P = 0.4附近具有強(qiáng)峰值。此分布不是H 0或H A下預(yù)期的形狀，反映了t檢驗(yàn)在 CLL 數(shù)據(jù)中的表現(xiàn)不佳。重要的是， t檢驗(yàn)中P值小于 0.01的 CpG 位點(diǎn)的百分比僅為 0.5%。

圖 4：應(yīng)用于 CLL 甲基化數(shù)據(jù)的建議檢驗(yàn)的P值分布。

圖 5：應(yīng)用于 CLL 甲基化數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)的P值分布。

甲基化高通量測序基因檢測質(zhì)量及控制標(biāo)準(zhǔn)分析與共識(shí)

對(duì)全基因組甲基化數(shù)據(jù)的分析賊近引起了很多關(guān)注。已經(jīng)提出了許多統(tǒng)計(jì)方法。然而，大多數(shù)方法都是針對(duì)微陣列生成的甲基化數(shù)據(jù)開發(fā)的。NGS 生成的甲基化數(shù)據(jù)對(duì)統(tǒng)計(jì)分析提出了若干挑戰(zhàn)。首先，與使用微陣列的甲基化實(shí)驗(yàn)不同，其中在特定 CpG 位點(diǎn)對(duì)一個(gè)個(gè)體進(jìn)行甲基化測量，這里甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組有每個(gè)個(gè)體的甲基化等位基因和非甲基化等位基因的計(jì)數(shù)。其次，由于測序覆蓋率的差異，受試者之間甲基化比例估計(jì)的正確性會(huì)有所不同。任何方法都應(yīng)適當(dāng)考慮這種差異。第三，真實(shí)β的分布是未知的，并且可能會(huì)影響任何關(guān)于均值β的檢驗(yàn). 第四，目前 NGS 測量每個(gè)樣本/受試者超過 200 萬個(gè) CpG 位點(diǎn)的甲基化。任何統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)都必須具有計(jì)算效率，才能應(yīng)用于高通量測序數(shù)據(jù)?？紤]到這些挑戰(zhàn)，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組提出了一種基于聚類數(shù)據(jù)分析的差異甲基化檢驗(yàn)，方法是直接對(duì)甲基化計(jì)數(shù)進(jìn)行建模。模擬結(jié)果表明，所提出的檢驗(yàn)在測量的甲基化水平的幾個(gè)分布下是穩(wěn)健的。所提出的檢驗(yàn)對(duì)于來自不同個(gè)體的覆蓋范圍的變化也是穩(wěn)健的。此外，所提出的檢驗(yàn)在計(jì)算上是有效的。在甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組的真實(shí)數(shù)據(jù)應(yīng)用程序中，只需 5 分鐘即可在超過 200 萬個(gè) CpG 站點(diǎn)執(zhí)行所有檢驗(yàn)。使用具有 3.3 GHz CPU 的臺(tái)式計(jì)算機(jī)在 R 中執(zhí)行計(jì)算。

盡管提議的檢驗(yàn)適用于基于二項(xiàng)式計(jì)數(shù)的差異甲基化檢驗(yàn)，但當(dāng)前的方法無法適應(yīng)諸如批次效應(yīng)或年齡和性別等協(xié)變量等因素。批次效應(yīng)可能在任何全基因組研究中都很重要。批次效應(yīng)可能會(huì)在測序覆蓋率方面進(jìn)入高通量測序甲基化研究。這里使用的檢驗(yàn)將解釋這種批次效應(yīng)。但是，在當(dāng)前檢驗(yàn)中可能無法正確考慮批次引起的任何其他隨機(jī)效應(yīng)。此外，已顯示相對(duì)甲基化水平與年齡密切相關(guān)和有性行為。未來的工作應(yīng)側(cè)重于擴(kuò)展此方法，以適應(yīng)協(xié)變量和批次效應(yīng)。

所提出的檢驗(yàn)的另一個(gè)限制是它是差異甲基化的單基因座測試，并且忽略了附近 CpG 位點(diǎn)之間的相關(guān)性。人們?cè)絹碓疥P(guān)注開發(fā)檢測差異甲基化區(qū)域 (DMR) 的方法?？梢詫⒓谆瘻y序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組提出的測試包含在用于檢測 DMR 的分層建模方法中?？傊?，甲基化測序與新一代測序技術(shù)應(yīng)用拓展重大課題組提出的測試是全基因組甲基化研究的有前途和實(shí)用的測試。由于其效率，它適用于全基因組研究中差異甲基化的先進(jìn)輪掃描。