【佳學基因檢測】造血干細胞基因編輯的臨床應用

造血干細胞基因編輯治療的臨床應用現(xiàn)狀

HSC加工方法的進步，加上越來越多的基因編輯工具，使人們對疾病的分子機制有了新的認識，并為多種疾病的治療開辟了新的領域，因此基因編輯已被用于多種治療方法，包括糾正致病點突變，通過靶向整合將治療基因添加到特定的基因組位點，去除或破壞突變等位基因，或調節(jié)疾病修飾基因的表達。因此，在過去的十年中，有大量的研究（表2）和13項臨床試驗（表3），通過結合人類原代造血細胞和基因編輯工具來治療非惡性疾病。

3.1. 血紅蛋白病-β-地中海貧血與鐮狀細胞病

β-血紅蛋白病、β-地中海貧血和鐮刀細胞?。⊿CD）代表全世界最常見的單基因疾病，估計每年有56000和270000例患病新生兒出生[185]。對于β-地中海貧血，HBB基因突變減少或者是消除β-珠蛋白的合成。對于SCD, 基因突變編碼合成有害的β-珠蛋白變體的形成（HBB:c.20A>T，成熟蛋白中的p.E6V）。β-珠蛋白是成人血紅蛋白（HbA，α2β2）的一個關鍵成分，在沒有這種成分的情況下，會形成有毒的α4同四聚體，產生的HbA不足?；蚪獯a發(fā)現(xiàn)，HBB中有300多種β-地中海貧血突變，與α-/β-珠蛋白鏈產生不平衡、祖細胞和紅細胞凋亡增加、紅細胞生成無效和貧血有關[186]。盡管基于常規(guī)治療（如終生輸血、鐵螯合治療地中海貧血和羥基脲治療SCD）的患者生存率有所提高，但由于輸血依賴性和伴隨的并發(fā)癥，患者的生活質量顯著降低。

與可以采用HSCT治療的其他疾病相比，血紅蛋白病以及致病基因清晰的和潛在致命性的單基因疾病由于患者人數(shù)眾多，促使了不成比例的大量往往是開創(chuàng)性的基因治療研究的發(fā)展。第一代先進的治療藥物（ATMPs）主要基于慢病毒介導的將正常的HBB樣基因拷貝添加到HSC中，并為自體基因修飾的HSC對β-血紅蛋白病的治療潛力提供了概念證明[10,11,12,13187]。然而，除了常見的HSCT相關的與骨髓清髓相關的風險，由于隨機整合而導致的插入突變是一個額外的揮之不去的擔憂。2021年2月，這促使藍鳥生物（Bluebird Bio）基于慢病毒的Zynteglo的試驗和銷售暫時中止，隨后，對一例急性髓系白血病和一例最初懷疑的骨髓增生異常綜合征病例之間因果關系的懷疑被消除[188]。對插入突變的關注成為新基因療法的開發(fā)工作長期以來的關注焦點。這種療法雖然仍然依賴于骨髓消融以支持體外HSC為基礎的策略，但本質上并不構成插入突變的風險，對于無DSB的方法，甚至可以消除意外重組事件的風險[29,30]。

β-血紅蛋白病的基因編輯療法主要基于三種方法，包括（i）通常基于HDR的致病突變校正，（ii）向內源性位點添加HBB轉基因或（iii）破壞γ-珠蛋白基因（HBG1和HBG2）轉錄抑制所需的基因或控制元件。至于（i）基因校正，大多數(shù)旨在直接校正致病突變的研究針對SCD突變（HBB:c.20A>T）或東亞和東南亞最常見的β-地中海貧血致病突變（HBB:c124-127del）[81,106,107,131,132,133,134,136,137,138,142]。對于這些和其他基因，點突變的校正通常依賴于CRISPR/Cas9系統(tǒng)和ssODN進行基于HDR的校正[81,107,132,136,137,138,141]，盡管也采用了基于NHEJ的開放閱讀框架外突變編輯[152189190]和堿基編輯[191,192]。值得注意的是，Hoban等人使用ZFNs對SCD患者來源的HSC中的β-珠蛋白基因座進行基于HDR的編輯，其中在IDLV和ssODN供體模板之間，使用100 bp的較長反向鏈ssODN實現(xiàn)了最高水平的修飾[82]。至于（ii）基因添加，在突變特異性校正的同時，一些研究小組還評估了HDR介導的HBB轉基因靶向插入到內源性位點，作為恢復正常β-珠蛋白水平的更普遍校正方法[106128129139]，進一步優(yōu)化HDR效率是基因加成治療的一個更安全、合理的下一步。至于（iii）基因破壞，大量研究關注負責γ-珠蛋白抑制的因子的失活，這反過來導致發(fā)育沉默的胎兒血紅蛋白（HbF）的表達，α2γ2異源四聚體清除多余的α-珠蛋白，在功能上取代正常成人血紅蛋白，并具有抗鐮刀特性。利用NHEJ在HSC中的流行性，一些研究小組集中于通過基于NHEJ的HBG1和HBG2基因沉默因子和調節(jié)因子的破壞或抑制來重新激活HbF，包括B細胞淋巴瘤11A（BCL11A）、Krüppel樣因子1（KLF1）和ZBTB7A，也稱為LRF[193,194]。對BCL11A和其他具有多譜系表達的基因進行治療性開發(fā)的一個關鍵先決條件是確定紅系特異性控制元件作為破壞靶點，使其他細胞譜系中的基因功能不受影響[143]。因此，許多研究表明，在核酸酶介導BCL11A基因或其結合位點中的紅系控制元件的破壞后，HbF的再激活[91,144,145,146,149]。這些通用方法在證明疾病表型的高效、安全和正確改善方面的成功導致了新穎人類臨床試驗的啟動，評估了CRISPR/Cas9（NCT03745287）和后來的ZFNs（NCT03432364）在治療β-血紅蛋白病方面的應用（表3）。

研究小組針對β-地中海貧血和SCD表型所采用的替代方法主要包括模擬與胎兒血紅蛋白遺傳持久性（HPFH）相關的遺傳畸變。在一種罕見的良性疾病中，個體在整個成年期都表達HbF，而在β-血紅蛋白病患者中表達HbF可以大大降低癥狀的嚴重程度。Traxler等人通過慢病毒CRISPR/Cas遞送和對HBG1和HBG2基因啟動子中自然發(fā)生的13 nt HPFH缺失的近似重演，證明了SCD CD34+HSCs中鐮狀表型的改善[144]。隨后，Lux等人提供TALEN編碼的mRNAs來模擬相同的HbF誘導13 nt缺失，從而類似地誘導胎兒血紅蛋白[154]。利用CRISPR/Cas核酸酶對，Ye等人在HBB基因座中誘導了12.9-kb的缺失，使HBG1/2基因保持完整，但基本上去除了HBD和HBB，這導致SCD表型的逆轉和SCD CD34+HSCs中HbF水平的增加[145]。除了傳統(tǒng)的核酸酶介導的基因編輯外，許多研究小組使用了不太傳統(tǒng)的策略來靶向β-血紅蛋白病，強調了基因編輯技術提供的治療靶點的多樣性。在許多經常顯示血紅蛋白病但同樣適用于其他疾病的獨立研究中，核酸酶的DNA結合域已被用于修飾表觀遺傳標記或創(chuàng)建合成轉錄或栓系因子[29,30]。從基因編輯到HSC的轉錄調控和表觀基因組編輯，相應的應用范圍超出了本文的范圍，Wilber等人的一項開創(chuàng)性研究可能僅是例證。將單純皰疹病毒激活域（VP64）與HBG1/2結合ZF DNA結合域融合，使原代紅細胞中的HbF上調至20.9%[195]，這取決于合成轉錄因子的持續(xù)存在。最后，與γ-珠蛋白一樣，α-珠蛋白是β-地中海貧血的關鍵疾病調節(jié)劑，因此α-地中海貧血突變的共同遺傳導致α-珠蛋白水平降低，從而改善β-地中海貧血表型。這使得Mettananda及其同事在編輯的β-地中海貧血CD34+HSC中能夠通過DSB介導的α-珠蛋白增強子缺失恢復正常的α/β-珠蛋白比率[148]，這與γ-珠蛋白本身不能治療不同，但與額外的治療劑結合可以改善治療結果[196]。

重要的是，血紅蛋白病也已采用不依賴于DSB的基因編輯方法進行研究。Liang等人很早就利用堿基編輯來靶向中國和東南亞引起β-地中海貧血的三種最常見的突變之一（HBB:c.28（A>G）），盡管不是在HSC中，而是在模擬人類胚胎的細胞系統(tǒng)中[140]。盡管基于堿基編輯器的正確編輯仍然受到近端（旁觀者）離靶堿基的無意改變的影響，但是在細胞系中使用基于基序的堿基編輯器已經允許校正HBB−28（A>G）（HBB:c.-78A>G）突變，具有最小的旁觀者編輯[192]，對HSC的未來編輯有意義。類似地，高度通用的素數(shù)編輯技術被用于逆轉SCD突變（一種顛換事件：GTG>GAG，V>E），但迄今為止，這僅在細胞系中得到證實[52]。相比之下，盡管僅限于不能逆轉SCD突變本身的過渡編輯，CD34+細胞中的堿基編輯最近被兩個里程碑式的研究所采用，這兩個研究對SCD治療的未來和血紅蛋白病治療的臨床轉化具有潛在的重要意義。首先，針對SCD突變本身并采用一種新的堿基編輯器重新設計PAM需求，Yen等人實現(xiàn)了鐮狀變體到非鐮狀變體Makassar的有效轉化（GTG>GCG，V>a）[197]。第二，Zeng等人使用堿基編輯使BCL11A紅系增強子區(qū)域失活，并在地中海貧血CD34+細胞中實現(xiàn)γ-珠蛋白誘導的治療水平[191]，這是堿基編輯的理想使用案例，旁觀者編輯不會造成損害，甚至可能導致靶序列失活。
 

3.2. 原發(fā)性免疫缺陷

原發(fā)性免疫缺陷（PIDs，也稱為先天性免疫錯誤）是一組異質性疾病，共有130多種罕見的遺傳性疾病，與免疫發(fā)育和功能異常有關[198]，在全球范圍內影響1:10000的活產嬰兒。在過去的幾年中，包括嚴重聯(lián)合免疫缺陷（SCID:X-SCID、ADA-SCID）、Wiskott-Aldrich綜合征（WAS）、慢性肉芽腫性疾?。–GD）和X-連鎖高IgM（X-HIM）在內的許多原發(fā)性免疫缺陷已經通過傳統(tǒng)的基于基因添加的方法得到了有效治療?；?gamma;-逆轉錄病毒的X-SCID早期臨床試驗雖然證明了遠遠超過常規(guī)治療的有效性和安全性，但在20名兒童患者中有4名患者出現(xiàn)了因為插入突變而引起的白血病[199]。盡管X-SCID中校正細胞固有的選擇性優(yōu)勢可能是造成這種現(xiàn)象的原因，該試驗促進了人們更加努力地去設計普遍更安全的基因添加載體，并同樣繼續(xù)推動對越來越多的PID的基因編輯研究，以將插入突變風險降至最低[17,43,170,171]。

3.2.1. 嚴重聯(lián)合免疫缺陷癥（SCID）

SCID以體液免疫和細胞介導免疫缺陷為特征，發(fā)病率為1:50000-100000出生，是最普遍的致命的PIDs。其中，Artemis（ART）-、RAG1-和RAG2-SCID在T細胞和B細胞受體成熟所需的重組事件中顯示出缺陷。這已通過分別使用編碼Artemis的DCLRE1C轉基因和RAG1轉基因的慢病毒分別進行轉導，并在慢病毒基因添加的相關臨床試驗（NCT03538899和NCT04797260）中針對人類HSPC中的ART-和RAG1-SCID進行了治療[200,201]。相比之下，X-連鎖SCID、X-SCID或SCID-X1，占SCID病例的40%以上，已經通過基于逆轉錄病毒基因添加的若干臨床試驗以及基于ZFN和CRISPR/Cas設計核酸酶的大量臨床前工作得到解決。X-SCID是由IL2RG基因的遺傳畸變引起的，該基因編碼白細胞介素-2受體γ鏈（IL2Rγ），是細胞因子受體的一個常見亞單位，包括IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21[202]。由于IL2RG功能缺乏所引起的細胞因子信號缺陷導致T細胞和自然殺傷（NK）細胞幾乎有效缺失，以及功能性B細胞發(fā)育受損[203]。在缺乏治療的情況下，患病男嬰在其生命的最初幾年因無法抵抗細菌、真菌或病毒感染而死亡。早期基因治療試驗表明，即使HSC糾正率很低，也可能導致正常T細胞免疫功能的實質性重建。迄今為止，針對HSC、IPSC和T細胞的基因校正和添加方法已被用于校正X-SCID相關突變和改善疾病表型[43,98，155，156，158，159]。Sangamo BioSciences領導的一項概念驗證研究，使用ZFNs和攜帶IL2RG外顯子5的質粒供體，實現(xiàn)了K562和T細胞中IL2RG基因的功能校正；盡管校正率不高[155]。隨后，San Raffaele Telethon基因治療研究所持續(xù)努力，建立理想的培養(yǎng)條件和交付編輯成分的時間，在患者來源的HSC（包括原始HSC）中實現(xiàn)了大量ZFN介導的IL2RG基因敲入置換[43156]。最近，另外兩項研究表明，使用ZFNs或CRISPR/Cas9對X-SCID患者源性hsc中的IL2RG位點進行高HDR介導的編輯，利用p53抑制和基于AAV6的供體遞送，使得校正細胞對NSG小鼠移植物的貢獻高達40%[98，159]。

 

3.2.2. Wiskott–Aldrich綜合征（WAS）

Wiskott–Aldrich綜合征是一種罕見的（1:100000出生）X連鎖隱性PID，由編碼WASP蛋白的WAS基因功能缺失突變引起，WASP蛋白是大多數(shù)造血胞系中肌動蛋白細胞骨架和免疫突觸形成的關鍵調節(jié)因子[204]。受影響的患者通常表現(xiàn)為血小板減少癥、反復性感染和濕疹，并且極易發(fā)生腫瘤和自身免疫性疾病。盡管臨床上的病人治療與健康管理有所改進，包括常規(guī)血小板輸注以及抗生素、抗病毒藥物和抗真菌藥物的應用，但對于嚴重型WAS患者，其預期壽命仍僅為15年。利用ZFN介導的WAS轉基因整合，為基于基因編輯的WAS校正提供了概念證明，該整合通過編輯患者源性IPSC后進行的[160]。最近，通過結合CRISPR/Cas9和AAV6供體載體，Rai等人在患者來源的HSC中實現(xiàn)了高達60%的治療性WAS cDNA靶向整合，從而為更有效、更安全的基于編輯的WAS治療方法奠定了基礎[161]。
 

3.2.3. 慢性肉芽腫性疾?。–GD）

由吞噬細胞煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH）酶復合物的任何亞單位的遺傳畸變引起，常染色體隱性（p22phox、p40phox、p47phox和p67phox）或X連鎖（gp91phox）慢性肉芽腫性， 是最罕見（1:200000出生）的PID之一。慢性肉芽腫性患者通常表現(xiàn)出對嚴重細菌和真菌感染的易感性增強，并由于無法解決相應的炎癥而處于超級炎癥狀態(tài)。治療方式包括終身抗生素/抗真菌預防以及采用干擾素-γ進行免疫調節(jié)。X連鎖CGD占CGD病例的60%以上，是迄今為止所有臨床慢性肉芽腫性試驗的目標。同樣地，常染色體隱性遺傳慢性肉芽腫性迄今為止只能通過基于IPSC和細胞系的編輯來解決[168169205]，而一些關于X連鎖慢性肉芽腫性的研究已經在HSC上進行了。在2016年的一項研究中，ZFNs和基于AAV6的供體模板實現(xiàn)了編碼gp91phox蛋白的CYBB轉基因靶向整合到惰性（“安全港”）AAVS1位點，并證明移植后17周細胞在NSG小鼠的骨髓中植入[97]。在采用CRISPR/Cas9與ssODN聯(lián)合的進一步研究中，同一組最初報告X-CGD患者源性HSC中CYBB 676C>T點突變，在短暫抑制p53介導的細胞凋亡和移植到免疫缺陷小鼠體內之前有12–31%靶向糾正[167]，使用健康供體細胞作為陽性對照，gp91phox陽性的長期再生細胞水平高達80%[89]。
 

3.2.4. 免疫調節(jié)性多內分泌腎病X連鎖腸?。↖PEX）

IPEX是一種罕見的X連鎖疾病，全球已知病例不到300例，以T細胞缺陷和自身免疫為特征，由調節(jié)性T（Treg）細胞的主要調節(jié)因子FOXP3基因突變引起[206，207]。盡管將FOXP3基因添加到具有組成性表達的CD4+T細胞中具有治療作用，但跨多個亞系的終身校正需要使用HSC進行生理性表達[208,209]。為此，最近通過CRISPR/Cas介導的位點特異性整合到FOXP3內基因的第一個編碼外顯子中，利用4.4kb HDR供體進行基于AAV6的遞送，進行了基于HSC的修復[170]。除了1.3kb的FOXP3 cDNA外，供體還包括截短的神經元生長因子受體（tNGFR），作為臨床兼容的選擇標記，使tNGFR陽性細胞富集到29±8%，并在NSG衍生小鼠中長期重建免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)重建率低，部分原因可能是供體結構中含有1.6-kb tNGRF表達盒[106]。
 

3.2.5. 高IgM綜合征（HIGM）

高IgM（HIGM）綜合征的特征是缺陷B細胞超突變和重組，這阻止免疫球蛋白類型從IgM轉換為其他免疫球蛋白型，從而導致對微生物感染的易感性[210]。作為一組疾病，HIGM 1型到5型是由影響DNA脫氨基（AICDA）、DNA斷裂（UNG）和CD40信號（CD40，CD40LG）的基因突變引起的，后者為通過B細胞與T細胞的相互作用來誘導類別轉換所需要。大多數(shù)HIGM患者為男性，受X 連鎖高IgMp綜合征影響，由影響T細胞表達CD40配體CD4OL的突變引起。由IPEX引起的HIGM, 矯正T細胞所提供的治療效果較短[171],w但是治療效應又一次的必需依賴在HSC水平上的的矯正，一是因為細胞的壽命，二是對于CD40和CD40LG來說，其他細胞如粒細胞也表達[211]。此外，CD40LG的高度調節(jié)瞬時表達似乎是避免惡性腫瘤所必需的[212]。為了解決HIGM1的所有這些問題，Kuo等人利用TALEN和CRISPR/Cas9核酸酶將CD40 LG的cDNA靶向插入內源性CD40LG啟動子下游和導致HIGM1的任何已知突變的上游[99]。在這種情況下，基于AAV6的HDR供體遞送遠遠優(yōu)于基于IDLV的遞送，并且對HSC衍生細胞的集落形成分析和大體積培養(yǎng)分析顯示，兩種核酸酶平臺的基因修飾率均高達28%。在體內研究中，移植導致60%的NSG小鼠出現(xiàn)胸腺重建，80%的NSG小鼠出現(xiàn)長期移植細胞陽性，平均整合率為4.4%。鑒于CD40LG/CD40相互作用的動態(tài)性質，即使外周細胞中10%的校正也可能促進治療水平上的類別轉換，因此方法上的微小改進可能足以在HIGM1患者中達到臨床相關療效。

 

3.3. 先天性細胞減少/遺傳性骨髓衰竭綜合征

先天性細胞減少癥，即一個或多個HSC衍生細胞系的先天缺失或減少，是由遺傳的或者是自發(fā)的影響骨髓的胚系突變引起的[213]。這些罕見貧血中最常見的是范科尼貧血（FA）、Shwachman-Diamond綜合征、Blackfan-Diamond貧血、先天性角化不良（DC）、先天性無核細胞血小板減少癥（CAMT）和網狀發(fā)育不良。在大多數(shù)情況下，尤其是早期治療，HSCT可顯著延長生存期，盡管HSC譜系以外的綜合征特征，如FA和DC中的早發(fā)鱗狀細胞癌，尚未得到解決。同樣的局限性也適用于矯正自體造血干細胞的治療性應用，其中受不同先天性細胞減少（包括FA）影響的造血干細胞具有作為矯正基質的劣勢。然而，這可以通過校正細胞明顯的體內增殖和存活優(yōu)勢得到補償[174]。迄今為止，在大多數(shù)先天性細胞減少的情況下，基因編輯僅限于在細胞系或模型系統(tǒng)中進行實驗[30214]，顯著的例外是FA的大量努力和成功（如下所述），以及CAMT CD34+細胞中基于突變特異性CRISPR/Cas修復的原理證明[181]。
 

范科尼貧血

FA是一種罕見的（1:100000）遺傳性疾病，其特征是所述22個FANC基因中的一個或多個發(fā)生突變，導致DNA損傷反應缺陷、身體異常和進行性骨髓細胞生產不足。受影響的患者通常表現(xiàn)為骨髓衰竭、身體異常和器官缺陷，特別容易發(fā)生癌癥。早期臨床試驗強調了從受影響患者中收集和處理自體HSC的挑戰(zhàn)，但同時證明了校正后的HSC比來自FA患者的突變HSC具有強大的植入能力和增殖優(yōu)勢[215]。到目前為止，許多研究小組已經利用核酸酶介導的基因編輯作為基于LV的基因添加方法的替代方法[173,174,175,216]。由于FA患者骨髓生態(tài)位的廣泛損傷以及HSC的數(shù)量和質量較差，早期概念驗證研究使用FA患者來源的成纖維細胞作為模型，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向FANC突變[173216]。然而，Diez等人除了FA患者來源的細胞系和健康的CD34+細胞外，還使用FA CD34+細胞來證明通過ZFN介導將FANCA供體引入AAVS1“安全港”位點來糾正FA表型的可行性[174]。Corn小組最近強調了有效利用HDR靶向FA致病突變的一個關鍵障礙，他們證明了FANC蛋白在Cas9介導的單鏈模板修復[217]和利用雙鏈供體DNA進行基于HDR的修復[218]中的作用。值得注意的是，Román-Rodríguez通過采用NHEJ介導的破壞來引入代償性突變，從而繞過了這一困難，從而恢復了FANCA、-C、-D1和-D2基因的表達[175]?；蛘?，基于HDR的修復的小分子抑制劑可用于提高HDR效率，即使在FA背景下也是如此[218]。

 

3.4. 遺傳性出血和凝血障礙

出血和凝血障礙包括出血時間過長（血友?。┖推渌俣冗^快（血栓性/高凝性）的情況，其極端形式可能致命。這兩種疾病可以互相解除復雜的血液酶級聯(lián)反應的調節(jié)，該級聯(lián)反應在沒有損傷的情況下通常保持不活動，并且在檢測到內皮細胞和內皮下細胞受損時通過血栓形成有效地密封血管壁。血友病和血栓性突變是共同的疾病修飾因子，因此血栓性風險因子的共同遺傳導致血友病較溫和的表型[219]。對于血栓性疾病，致病突變包括因子V Leiden和2021G>A凝血酶原突變，在罕見但通常更嚴重的病例中，是抗凝血酶III、蛋白C和蛋白S的突變[220]。對于血友病，X染色體編碼凝血因子VIII和IX中總共有1000個以上突變分別引起血友病A和B，而第4號染色體席因子XI突變引起血友病C[221]。在出血和凝血障礙中，迄今為止所有處于進展期的臨床前和臨床基因治療研究都集中于血友病A或B。

 

血友病

凝血因子VIII和IX的自然產生發(fā)生在肝臟中，因此大多數(shù)已發(fā)表的基因治療方法使用AAV載體在肝細胞中進行體內基因添加或基因編輯[179,222,224]。特別值得注意的是其原量為，在ZFN介導的靶向整合后，在內源性白蛋白基因啟動子的控制下，因子VIII和IX的cDNA表達原理[225]。然而，有幾種新方法采用體外操作HSC來研發(fā)治療方案[226]。例如，基于HSC的慢病毒基因添加方法的臨床試驗包括系統(tǒng)表達因子VIII或IX[227228]和表達血小板保留因子VIII，以避免因子VIII不必要地暴露于免疫系統(tǒng)[229]。編輯方法現(xiàn)在利用了HSC衍生表達的相同原理，包括在內源性α-珠蛋白啟動子控制下靶向整合因子IX cDNA[162]，其中，可分散因子的高水平表達可補償?shù)驼闲屎偷颓逗系慕涍^編輯的長期再植入HSC。
 

3.5. 血液之外

除了應用于血液疾病外，HSCT還可以在噬血細胞疾病中替代作用于實體器官的吞噬細胞，或在代謝疾病或蛋白質缺乏癥中終身提供或其他蛋白質治療[3]。在所有這些情況下，基于對自體造血干細胞甚至超越造血干細胞的衍生組織的修飾，基因治療和基因編輯可能再次獲得與傳統(tǒng)造血干細胞移植相同的治療效果，但不存在與異基因移植相關的風險。在血液循環(huán)之外，基于HSC的蛋白質遞送的絕大多數(shù)研究和成功都是針對先天性代謝紊亂的，但新的靶點正在出現(xiàn)。

3.5.1. 先天性代謝錯誤（IEMs）

IEM描述了一大類異質性遺傳疾病，通常由酶或轉運蛋白缺陷以及共同代謝途徑中的相應阻斷引起。這會導致大分子的毒性積聚和細胞功能障礙。單一的IEM很少見，但作為一類疾病，IEM的發(fā)病率因人群而不同，可高達1:800。苯丙酮尿癥（PKU）和中鏈?；o酶A脫氫酶（MCAD）缺乏癥（發(fā)病率分別為1:10000和1:20000）是最常見的疾病[230]。在更常見的IEM中，溶酶體儲存疾病是一組約50種罕見的遺傳性代謝紊亂，由溶酶體功能缺陷引起。IEM的其他主要類別是糖原儲存障礙和過氧化物酶體障礙[231]。姑息性治療，例如通過酶替代療法，成本高昂，且并非普遍有效。與血友病類似，代謝性疾病可通過體內編輯肝細胞和內源性白蛋白啟動子控制下的酶表達來治療，如在Fabry病、Gaucher病和Hurler和Hunter綜合征缺乏蛋白質的小鼠中所證明的[225]。重要的是，在20多年的時間里，對這些疾病采用富酶細胞進行HSCT治療已經長達20多年。因為缺乏的酶的不同及疾病階段不同，成功程度不一樣[232]。這促使Pavani等人在HSC中進行靶向整合，以解決Fabry病、Wolman病和Hurler綜合征潛在的酶缺陷，這與他們在同一研究中α-珠蛋白啟動子驅動治療血友病的凝血酶驅動因子表達的研究一致[162]。至于出血性疾病，HSC的高水平表達和易于操作的潛力可能使HSC衍生的可溶性因子表達對于代謝和其他疾病的未來治療具有極大的重要性。
 

3.5.2. 神經病

HSC來源的細胞可以通過血腦屏障，從而促進相互作用的工程性改變或蛋白質分泌，具有治療效果。這一點可以通過釋放促凋亡化合物來實現(xiàn)小鼠腦腫瘤的減少[233]?；诨蚓庉嫾夹g的這一策略最近的一個顯著發(fā)展是應用于Friedreich共濟失調，這是一種由FXN基因中致病性GAA三核苷酸重復擴增引起的神經退行性疾病。將正常HSC移植到該疾病的小鼠模型中，可以將正常蛋白質從HSC衍生的免疫細胞轉移到受影響的神經元和心肌細胞，從而產生治療效果[234]。為了通過移植校正的HSC實現(xiàn)相同原理的臨床轉化，CRISPR/Cas介導的人類HSC中GAA重復的切除允許正常線粒體功能和細胞的造血分化[235]。

 

3.6. 后天性和復雜性疾病

本綜述中的治療應用和疾病實例集中于HSC編輯在遺傳性疾病，特別是單基因疾病治療中的應用。然而，值得注意的是，HSC和相應譜系的基因編輯也被用于對抗獲得性和復雜疾病，包括感染和癌癥，最近在其他地方進行了綜述[236,237,238,239]。前者的一個突出例子是針對HIV相關獲得性免疫缺陷綜合征（HIV/AIDS）的抗性改造，其中CD4共受體CCR5和趨化因子受體CXCR4介導不同HIV毒株的感染，并可在T細胞或HSC中編輯或沉默，以使HIV靶細胞對病毒產生抗性[182,183,184,240]?；蚓庉嬙诎┌Y中最突出的應用，具有廣泛的臨床意義，是在創(chuàng)造嵌合抗原受體T和NK細胞，用于有效的腫瘤免疫治療[239]。除了應用于治療之外，HSC中的基因編輯已經有助于全基因組基因篩查，有助于對腫瘤和其他復雜或獲得性疾病的潛在途徑和驅動基因的理解，HSCT目前被用作對這些疾病治療方式[241,243,244]。由于單個細胞的逃逸在腫瘤性疾病中是有害的，特別是對于影響HSC及其后代的非腫瘤性復雜疾病的治療，基因編輯在未來可能具有直接的治療作用。這些疾病中有許多具有遺傳成分或特征的細胞途徑變化，作為治療目標的暫定指標[245,246]。

 

4.臨床應用過程中的突出挑戰(zhàn)

基于50多年的HSCT經驗和無數(shù)臨床前試驗和120多項臨床試驗的知識，包括通過基因添加進行的基于HSC的基因治療干預，使用HSC的基因編輯療法在不到十年的時間內從試驗臺轉移到了床邊。除了細胞分離和培養(yǎng)方面的持續(xù)技術創(chuàng)新外，基因添加試驗和通過建立相應的商業(yè)、制造、臨床和供應基礎設施產品的開創(chuàng)性商業(yè)化加快了基因編輯的臨床應用，并啟動相應監(jiān)管機構和準則的國際協(xié)調[84]。特別是在基因編輯方面，現(xiàn)有的應用已經顯示出高度的通用性，以及潛在的安全性和有效性，超出了基因添加所能實現(xiàn)的范圍。然而，許多挑戰(zhàn)和缺點仍然存在。

 

4.1. 技術挑戰(zhàn)和實際限制

高效的HSC細胞內傳遞、微調的編輯器活性和可編程編輯器的高度特異性是成功臨床應用的先決條件。除了編輯技術本身，臨床試驗方案需要考慮的參數(shù)包括HSC來源和質量、患者的健康狀況、疾病和修飾基因型以及實驗條件方案的選擇。在所有這些因素中，細胞材料的選擇、適當?shù)呐囵B(yǎng)、編輯的正確性和避免骨髓消融（如通過體內程序）是優(yōu)化的重要目標。

4.1.1. 細胞產量和組成

根據目前的方案，獲得足夠數(shù)量的造血干細胞進行有效的體外基因改造和后續(xù)移植可能并不總是可能的，因為某些疾病會影響骨髓并降低造血干細胞的數(shù)量和質量。原始HSC的微妙性質以及在制造過程中濃縮、培養(yǎng)、冷凍和解凍過程可能造成的細胞損失，加劇了這種情況[247]。因此，為了改善LTR-HSC操作和較低的載體需求，需要針對相應的細胞產量損失，對CD34+細胞的HSC特異性亞組進行富集。此外，據報道，輸注經基因編輯的造血干細胞和未經基因編輯的造血祖細胞的混合群體可以改善移植和造血重建[75,77]，這些造血祖細胞可能已免于體外培養(yǎng)和基因操作。因此，除了大多數(shù)臨床試驗方案要求少量（1.5–2.0×106 CD34+/kg）未經修飾的造血干細胞在植入失敗時作為“后備”儲存外，保存和對未操縱的細胞進行祖細胞選擇與編輯的細胞聯(lián)合移植可能會改善自體HSCT后的髓系重建。
 

4.1.2. 保持干性

高效體外編輯HSC需要培養(yǎng)HSC，但已證明對其干細胞特性和植入能力有負面影響。為了克服這個問題，在培養(yǎng)方案中引入了許多干細胞生態(tài)位調節(jié)因子（PGE2、SR1和UM171），以維持和擴大有助于移植的最原始的具有長期再植入能力HSC部分。包括這些調節(jié)物的進一步的臨床安全性和可行性研究，將允許評估它們的能力，以確保在無副作用的情況下保存基因編輯的HSC的長期多系潛能[248,249]。

4.1.3. 精密修復

容易出錯的NHEJ介導修復的優(yōu)勢和在最原始的HSC中HDR的有限效率一直是HSC基因編輯療法的一個長期挑戰(zhàn)，因為通過堿基編輯的DSB獨立正確編輯已經顯示出其在HSC正確修復中的臨床轉化潛力[191，197]并且由于引物編輯開始在原代細胞中實現(xiàn)高效率的正確編輯[250]。為了提高基于DSB的HSC正確編輯，許多研究致力于抑制NHEJ、提高HDR或調節(jié)核酸酶活性，而延長活化時間和允許在不損害其功能特性的情況下建立HSC HDR增強條件的最佳條件仍然是難以捉摸的[86,88,251]。此外，去除未經編輯的原始干細胞（可能與經編輯的細胞競爭植入）可能提供一種替代途徑，以彌補編輯效率和HDR頻率不足[106,113]，盡管使用可選擇標記進行移植可能有其自身的缺點[106,170]。
 

4.1.4. 走向更安全的調節(jié)和體內編輯

體外HSC編輯與臨床試驗中的不良事件有關，特別是患者準備已成為多項研究中的一個改進目標。在某些情況下，如X-SCID，使用細胞毒性烷化劑（如白消安）進行有效骨髓消融與治療相關死亡率升高相關，在X-SCID中，發(fā)現(xiàn)使用混合藥物進行溫和準備足以使B細胞的供體細胞重建[252253254]。其他PID，其中替代條件必須在個體基礎上進行評估[254]，血紅蛋白病也是如此[255，256]。對于其他疾病，如FA，無需有效準備即可實現(xiàn)有效治療[14]，而創(chuàng)新的選擇性調理方法，如靶向CD117或CD300f的細胞特異性藥物遞送，以及使用非基因毒性藥物，如saporin，正在對一系列疾病進行研究，以將治療相關的造血惡性腫瘤風險降至最低[55，257，258，259]。

重要的是，使用基于病毒或基于脂質的納米顆粒對HSC進行體內基因編輯可能有效避免預處理，并可能通過提供潛在更安全和更易于應用的治療方案在HSC基因編輯療法方面取得突破。然而，到目前為止，這只應用于小鼠模型[59,62，150]，擴大這一過程將帶來新的挑戰(zhàn)。這種方法的好處不僅包括其不依賴于骨髓消融和細胞分離程序，而且避免了作為治療產品的患者特異性修飾細胞周圍的物流，盡管目前它的主要缺點包括亞治療效率和編輯靶細胞甚至生殖細胞的風險。值得注意的是，HSCT治療的大多數(shù)疾病是隱性的，通常與蛋白質數(shù)量或功能減少有關。鑒于生物系統(tǒng)中頻繁的功能冗余和體內選擇的校正細胞，因此僅校正一部分患病細胞通常足以逆轉疾病病理學和改善癥狀。事實上，移植后隨訪研究表明混合造血嵌合體低至10–30%，與SCD、地中海貧血、SCID和其他PID患者的臨床癥狀改善和不再依賴于輸血有關[260，261]。
 

4.2. 安全

基于基因編輯的治療是一個相對年輕的研究領域，盡管已經取得了顯著的成就，但關于長期風險、編輯效應的持續(xù)性以及基因編輯的造血干細胞的安全性的數(shù)據仍然缺失。從最初用于基因添加的γ-逆轉錄病毒和慢病毒載體長達十年的臨床應用中獲得的一個關鍵教訓是，即使在最有責任心和知識最淵博的參與者手中，每一項新的ATMP技術都會帶來殘余風險和揮之不去的未知因素[262]。此外，在臨床基因添加試驗的隨訪期間可能進行的克隆分析揭示了克隆HSC潛伏期的階段和對血液重建的貢獻[73263]，這也將決定基因編輯試驗的有效性和長期安全性。展望未來，與基因添加面臨的風險密切相關，目前基因編輯技術的主要關注點包括DSB誘導的危險性、編輯細胞的長期穩(wěn)定性、治療的免疫原性以及風險與效益的總體比例。

4.2.1. DSB誘導

核酸酶介導的基因編輯可觸發(fā)細胞內防御機制和下游反應，影響HSC的增殖、存活和分化[264]。特別是，由于傳統(tǒng)核酸酶編輯器對高效DSB誘導的固有依賴性，可能會導致p53介導的DNA損傷反應、細胞周期阻滯或HSC干細胞干性的改變，因此產生了安全問題[41,46，265]。幾項研究表明，暫時抑制p53會降低DNA損傷反應并增加HDR水平[89,98,159]，但鑒于p53的腫瘤抑制功能，需要進一步的工作來評估使用此類抑制劑的安全性，在這種情況下，即使是特定于目標的DSB依賴性編輯事件也會導致造血異常[46,47,48,49，266]。由于單一靶向DSB事件可能已經引發(fā)染色體重排，并可能帶來災難性后果，因此，在序列類似的非靶向位點上的無意切割將加劇重組事件的發(fā)生或可能誘發(fā)indel形成，可能通過癌基因的反式激活或腫瘤抑制基因的失活導致不良事件。因此，與基因添加的插入突變風險類似，HSC中用于基因編輯的非靶向突變風險因其獨特的自我更新和多能性而引起長期安全問題。值得注意的是，nickase介導的堿基和引物編輯工具可能會像基于DSB的編輯器一樣顯示序列依賴的非靶點活動，但它們在靶點和非靶點誘導DSB和INDEL的傾向性大大降低。因此，在可能的情況下，基于DSB的編輯越來越多地被堿基編輯或引物要編輯技術所取代，盡管后者仍需進行大量優(yōu)化[267]。

4.2.2. 長期穩(wěn)定性

在最終的基因編輯產品中實現(xiàn)持續(xù)的和治療相關的校正水平是治療中最關鍵的方面之一。盡管據報道在大多數(shù)臨床前研究中獲得了良好的基因編輯產物植入率，但最近的研究表明在移植后8-16周內編輯細胞的頻率降低[81,87，106]。這是由于原始造血干細胞的基因編輯效率低下，還是由于它們在體外培養(yǎng)和操作后無法自我更新，仍有待確定。目前，大多數(shù)基于HSC基因編輯的臨床研究仍處于早期階段，加上通常較小的樣本量，損害了對編輯后的HSC在體內長期行為的一般預測。

4.2.3. 免疫原性

設計核酸酶的體內傳遞比體外應用面臨更大的障礙，因為將外來顆粒引入人體會產生免疫原性，因此患者需要接受免疫抑制治療。這對于CRISPR/Cas平臺的體內基因編輯尤其重要，因為通常預先存在對蛋白質成分的免疫力[109]。因此，除了累積非靶點突變的風險外，長期暴露于Cas9的潛在免疫原性也是編輯成分高度瞬時表達的另一個理由。未來應對基因編輯挑戰(zhàn)的其他方法可能是常規(guī)免疫抑制方案[268]，治療前自體調節(jié)性T細胞的體外擴增和再融合[269]，或者更根本的是，Cas9的靶向表位消除[270]或其先前不可能存在暴露的Cas9變異體。

4.2.4. 風險獲益合理性

與早期X-SCID基因添加試驗中白血病病例后基因治療領域普遍遭受挫折類似，任何基于HSC基因編輯的治療不良事件都可能危及整個治療類別的社會支持。此外，支持性治療的進展以及許多遺傳性疾病患者生活質量和生存率的提高要求仔細評估基因編輯療法與傳統(tǒng)療法相比的潛在風險和益處。對于總是致命的遺傳性疾病或對常規(guī)治療無反應的患者，基因編輯的風險策略似乎是可以接受的，而對于其他情況則不會。即使在沒有不良事件的情況下，不負責任地使用編輯技術也是不可接受的，并將正確地引起社會反彈，正如2018年有效無償且技術上有缺陷地使用生殖系編輯來設計產前抗艾滋病毒的情況所觀察到的那樣[271]。

4.3. 成本和公眾訪問

在過去十年中，ATMP產品市場大幅擴張，預計到2025年價值將超過112億美元[272]。然而，ATMPs的高成本阻礙了其廣泛應用，這部分是基于對患者和醫(yī)療機構支付意愿的精明評估，但也基于高開發(fā)和生產成本、高安全標準，與績效相關的報銷模式和目前臨床級試劑的短缺。盡管在2009年至2019年3月期間有14種ATMP獲得了市場授權，但有四種ATMP因商業(yè)原因已被撤回，而基因添加β-血紅蛋白病藥物Zynteglo因價格分歧剛剛從歐洲最大的單一經濟體德國撤回[273]。這些事件表明，在基于HSC的一次性治療性ATMP的新興業(yè)務中，剩余的關鍵挑戰(zhàn)是獲得治療以及產品和服務的可負擔性和商業(yè)可持續(xù)性。
 

4.3.1. 可及性

盡管投資者和公眾越來越感興趣，但基于基因治療的ATMP在臨床評估和批準后面臨的一個主要挑戰(zhàn)是成本和患者可及性。驅動高成本的一個主要因素是生產GMP級HSC所需的大量臨床（良好生產規(guī)范，GMP）級產品。與通常使用0.2–1×106 CD34+細胞進行的研究規(guī)模細胞編輯不同，臨床規(guī)模細胞編輯和移植的目標劑量為2–20×106 CD34+細胞/kg，這消耗了大量昂貴的GMP級試劑和產品開發(fā)和質量認證所需的分析。此外，對于一些疾病，可能需要對多個造血細胞系進行體外基因編輯評估，這進一步增加了制造過程的長度和成本。此外，全球只有少數(shù)醫(yī)療中心在基因治療和基因編輯治療方面擁有臨床水平的專業(yè)知識，這縮短了供應，需要細胞和試劑轉移，并進一步限制了患者獲得治療的機會。制藥公司和學術界之間日益增強的伙伴關系有助于加速基因編輯技術的臨床轉化，同時可能會扼殺針對少數(shù)患者群體的罕見和可能無利可圖疾病的ATMPs開發(fā)。此外，許多受遺傳性血液病影響的患者生活在發(fā)展中國家，如非洲的SCD患者和中東和南洋的許多地中海貧血患者，而ATMP的業(yè)務和研究則在別處進行。ATMPs中利益相關者的地理分布，加上相關公司提供投資回報的壓力，提出了一個問題，即是否會推動新興和救生治療的普及，并使大多數(shù)患者負擔得起。

4.3.2. 可持續(xù)性和負擔能力

為了使基于自體HSC基因編輯的療法滿足其潛力，需要開發(fā)新的財務模型和報銷政策和流程，以使患者能夠獲得這些治療，同時允許公司蓬勃發(fā)展。遺憾的是，鑒于患者群體規(guī)模通常較小，且為個體患者量身定制的制造過程冗長復雜，ATMP通常被視為商業(yè)價值低、商業(yè)風險高的產品。此外，大多數(shù)可通過編輯HSC治療的疾病都是由多個基因的大量突變引起的，在沒有通用疾病修飾劑的情況下，這些突變會成倍增加ATMP開發(fā)工作和投資，從而將治療推向市場和患者。通過體內HSC基因編輯可以降低成本，這將在概念上提供一個更優(yōu)雅的制造和供應系統(tǒng)，利用可直接給患者服用的現(xiàn)成產品。為了取得進一步進展，需要克服與靶組織特異性、免疫原性、生物分布和療效相關的主要障礙。類似地，子宮內基因治療的概念[58,60,61]為早期臨床干預提供了機會，大大減少了GMP級試劑的使用，可能為需要資源的體外HSC基因編輯提供了另一種解決方案。為了在這方面取得進一步的進展，需要首先在大型動物模型和新的立法和指南中提供更多的數(shù)據。無論如何，支付治療的意愿不僅要考慮替代治療的年度和終身成本，還需要考慮由于患者生產力的降低而產生的間接成本以及與患者及其家屬的疼痛和心理痛苦相關的無形成本?？紤]到社會成本，隨著不斷發(fā)展，進一步降低開發(fā)和治療成本，在未來幾年，通過HSC基因編輯進行治療可能成為越來越多的慢性病患者負擔得起和合理的治療方法。
 

5.結論

HSC的分離、表征和操作方面的巨大進步，加上日益多樣化的基因編輯工具組合，為疾病的潛在分子機制提供了新的見解，并為許多疾病的治療開辟了新的領域，為許多至今無法治好的疾病的治療帶來希望。HSC與基因編輯工具相結合已經在大量血液學和非血液學疾病的臨床前治療中顯示出成功。部分由于可編程核酸酶及其在體內和臨床應用的歷史相對較短，關于基因編輯產品在患者中的短期和長期副作用仍有許多未知因素。在可能的情況下，需要考慮無DSB技術、短期試劑暴露、LTR HSC編輯和安全細胞處理、治療前準備或體內治療方案，以降低患者的潛在風險。相應地，GMP生產的透明度和標準化、臨床前安全性和有效性評估以及臨床隨訪都是必需的，更大患者群體的臨床試驗和更長的隨訪也需要如此，以確定這些干預措施的長期療效和安全性。在目前通過基于HSC的基因編輯擴大和改進治療的軌道上，該技術可能很快成為許多威脅生命的疾病治療的標準，這反過來又需要標準化的國際監(jiān)管框架。實現(xiàn)基于HSC的自體基因編輯療法的前景將取決于臨床級試劑和程序的可擴展性，以及這些新療法對需要的患者和社區(qū)的可承受性和可獲得性。

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