【佳學(xué)基因檢測(cè)】腫瘤靶向藥物治療中耐藥性的獲得基因檢測(cè)分析

【佳學(xué)基因檢測(cè)】腫瘤靶向藥物治療中耐藥性的獲得基因檢測(cè)分析

配對(duì)外顯子組測(cè)序結(jié)果用于開發(fā)靶向測(cè)序 panel，用于所有可用配對(duì)血漿樣本的錯(cuò)誤校正 ctDNA 測(cè)序，每個(gè)樣本的 DNA 輸入兩個(gè)獨(dú)立的文庫制備物，并在兩個(gè)具有不同基礎(chǔ)化學(xué)的測(cè)序平臺(tái)上測(cè)序，然后一起比較 最終分析減少PCR錯(cuò)誤和測(cè)序錯(cuò)誤。 靶向 panel 包括 RB1、CDK4、CDK6、CDKN1A、CDKN2B、NF1、TP53 外顯子 5-8 的所有編碼外顯子，以及 PIK3CA、ESR1、ERBB2、FGFR1、FGFR2、FGFR3、AKT1、KRAS、NRAS 中的已知突變熱點(diǎn) 和 HRAS。 RB1 是在現(xiàn)有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上納入的，在外顯子組測(cè)序后添加了 FGFR1/2/3 和 NF1。 除了進(jìn)行配對(duì)外顯子組測(cè)序的 14 名患者外，還在第 1 天和 EOT 生成了 206 名患者的文庫以進(jìn)行靶向測(cè)序。 這些樣本在 Ion Proton 上進(jìn)行了測(cè)序，第 1 天和 EOT 樣本的中位覆蓋率分別為 2187X 和 3251X，在 Illumina HiSeq 2500 上的第 1 天和 EOT 樣本的中位覆蓋率分別為 10637X 和 8947X，產(chǎn)生了 184 名患者的配對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù) 兩個(gè)平臺(tái)都滿足質(zhì)量要求（材料和方法，補(bǔ)充圖 1）。 結(jié)合配對(duì)外顯子組測(cè)序，這產(chǎn)生了 195 名具有配對(duì) ctDNA 測(cè)序數(shù)據(jù)的患者（兩組中均包括 3 名患者，補(bǔ)充圖 1），以研究選擇使用哌柏西利加氟維司群 (n=127) 或氟維司群和安慰劑 (n=68) 進(jìn)行治療 ).

最初將兩個(gè)治療組放在一起考慮，總體而言，在治療結(jié)束時(shí)檢測(cè)到的突變比在第 1 天時(shí)多，第 1 天時(shí) 105 名患者檢測(cè)到 183 個(gè)變異，而治療結(jié)束時(shí) 119 名患者檢測(cè)到 243 個(gè)變異（圖 2A）。 60 名患者在治療結(jié)束時(shí)至少有一個(gè)新檢測(cè)到/獲得性突變 (60/195, 30.8%)。 治療結(jié)束時(shí)獲得突變似乎并未反映第 1 天腫瘤含量低，因?yàn)樵谟泻蜎]有獲得性突變的患者中檢測(cè)到的第 1 天突變比例相似（35/60, 58.3% 對(duì) 70/135, 51.9 ％ 分別）。 此外，基線時(shí)腫瘤純度 >10% 的患者比例沒有顯著差異（有獲得性突變的患者為 20.8%，無獲得性突變的患者為 31.0%，p = 0.21，F(xiàn)isher 正確檢驗(yàn)），使用 SNP 面板計(jì)算 n = 163 第 1 天樣本的子集。 兩個(gè)治療組中獲得至少一種新突變的患者比例相似，哌柏西利加氟維司群組為 39/127 (30.7%)，安慰劑加氟維司群組為 21/68 (30.9%)。

PALOMA-3 配對(duì)血漿樣本中乳腺癌驅(qū)動(dòng)基因的遺傳景觀，治療時(shí)經(jīng)常選擇突變

A – 配對(duì)的 ctDNA 測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)驅(qū)動(dòng)基因組（SNV 和插入缺失）中包含的基因中觀察到的變異頻率。 顯示了 195 名患者的第 1 天和治療結(jié)束時(shí)的結(jié)果，這些患者具有第 1 天和 EOT 的匹配數(shù)據(jù)。 P 值具有連續(xù)性校正的 McNemar 檢驗(yàn)。

 

B – 在接受哌柏西利加氟維司群治療的患者中，在 EOT 時(shí)發(fā)現(xiàn)的 RB1 突變 (6/127)。 在接受安慰劑和氟維司群治療的患者 (n = 68) 的 EOT 血漿樣本中未發(fā)現(xiàn) RB1 突變。 數(shù)字 PCR 圖顯示了來自患者 418 的 EOT 樣本中 Q257X 的正交驗(yàn)證。

 

C – 治療結(jié)束 (EOT) ctDNA 測(cè)序結(jié)果來自 195 名患者的配對(duì)樣本，按治療分開，以及在第 1 天和 EOT 之間治療時(shí)突變狀態(tài)是否發(fā)生變化。 195 名患者的隊(duì)列由靶向測(cè)序隊(duì)列（n = 184）和外顯子組測(cè)序隊(duì)列（n = 14，兩組中 n = 3）組成。 兩個(gè)治療組的突變獲取模式相似。

 

SNV – 單核苷酸變異，indel – 插入或缺失，EOT – 治療結(jié)束，ctDNA – 循環(huán)腫瘤 DNA。 混合——在第 1 天和 EOT 時(shí)同一基因具有不同變異的患者。

6 名患者在治療結(jié)束時(shí)獲得了可檢測(cè)到的 RB1 突變（p = 0.041，McNemar 連續(xù)性校正檢驗(yàn)），所有這些患者都接受了哌柏西利加氟維司群治療。 這 6 名患者中有兩名有 2 個(gè) RB1 畸變，一名患者之前已從外顯子組測(cè)序中鑒定出來，表明存在多克隆耐藥亞克隆（圖 B）。 樣本 418 中發(fā)現(xiàn)的 Q257X 突變也通過 ddPCR 進(jìn)行了驗(yàn)證（圖 B）。 在獲得 RB1 畸變的 6 名患者中，所有 8 種變體都是終止密碼子的增加或移碼缺失，極有可能導(dǎo)致 Rb 功能的廢除。 發(fā)生 RB1 突變的 6 名患者中有 4 名還具有等位基因分?jǐn)?shù)高得多的 PIK3CA 突變，這表明 RB1 突變可以反映亞克隆。 考慮到兩種正交測(cè)序方法，即擴(kuò)增子和外顯子組捕獲，在 palbociclib 加氟維司群組的治療結(jié)束時(shí)都發(fā)現(xiàn)了相似的治療結(jié)束 RB1 突變頻率（外顯子組測(cè)序 7.1%，1/14，擴(kuò)增子測(cè)序 3.9%，5/ 127). 這些觀察結(jié)果支持在 palbociclib 的壓力下獲得或選擇 RB1 畸變的出現(xiàn)，但僅在少數(shù)患者中 (6/127, 4.7%)。 雖然我們?cè)诘?1 天沒有發(fā)現(xiàn)任何 RB1 突變，這是偶然的結(jié)果，但我們?cè)诟鼜V泛的 331 天 1 樣本中發(fā)現(xiàn)了 2 名患者（在氟維司群加安慰劑組中）RB1 突變，其中包括沒有 EOT 樣本的患者。

除了在 palbociclib 上出現(xiàn) RB1 突變外，通過治療對(duì)變體的分析揭示了不同基因的不同模式，但治療組之間的模式相似（圖 C）。 對(duì)于 TP53，第 1 天出現(xiàn)的變異主要持續(xù)/維持（圖 A、圖 C），這與這些基因中通常代表軀干變化的變異一致。 一名患有第 1 天 TP53 突變的患者在 EOT 獲得了 8 個(gè)新檢測(cè)到的 TP53 變異。

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