【佳學基因檢測】腫瘤靶向藥物阿來替尼（Alectinib）使用前基因檢測

為什么使用阿來替尼前需要進行靶向藥物基因檢測？

酪氨酸激酶抑制劑間變性淋巴瘤激酶 (ALK-TKI)（包括阿來替尼）已成為 ALK 融合基因陽性非小細胞肺癌 (NSCLC) 的標準療法。在 NSCLC 中已發(fā)現(xiàn)多種 ALK 融合變異體，主要變異體為棘皮動物微管相關蛋白樣 4-ALK (EML4-ALK) 變異體 1 (V1)、V2 和 V3a/b。然而，關于這些變異體對 ALK-TKI 的臨床反應的報道存在爭議，關于其他不太常見的 ALK 變異體的報道較少。為了檢驗 ALK 變異體對 ALK-TKI 療效的影響，腫瘤基因解碼基因檢測是分析了 8 種 ALK 變異體對阿來替尼的敏感性：3 種主要變異體（V1、V2 和 V3a）和 5 種不太常見的變異體（V4；驅動蛋白家族成員 5-ALK；驅動蛋白輕鏈 1-ALK；紋狀體、鈣調蛋白結合蛋白-ALK；和原肌球蛋白受體激酶融合基因-ALK）。使用重組蛋白進行無細胞激酶測定，并使用表達 ALK 變異體的小鼠 Ba/F3 細胞進行細胞生長測定。每種重組蛋白的激酶活性都被阿來替尼顯著抑制。在每個表達 ALK 變異體的 Ba/F3 細胞中，阿來替尼抑制了細胞內 ALK 磷酸化水平及其下游信號傳導介質 STAT3 和 ERK。每種細胞的增殖均受到阿來替尼治療的顯著抑制。細胞之間的 IC 50值沒有顯著差異，反應性差異小于 3.6 倍?？傊?，這八種 ALK 變異體在體外對阿來替尼的敏感性相似，這表明可能無法僅通過確定 ALK 融合陽性 NSCLC 中的 ALK 變異體類型來預測對阿來替尼的反應。

腫瘤靶向藥物阿來替尼（Alectinib）使用前基因檢測關鍵詞

阿來替尼、ALK、EML4、融合、KIF5B、KLC1、肺癌、STRN、TFG、變異

不同的肺癌患者具有不同的基因突變，可以由肺癌基因檢測進行明確

不同的肺癌患者有不同的基因突變，使得它們對靶向藥物的敏感性不同。根據(jù)《腫瘤靶向藥物基因檢測》，8% 的非小細胞肺癌 (NSCLC) 患者發(fā)生間變性淋巴瘤激酶 (ALK) 基因重排。研究發(fā)現(xiàn)，ALK 融合陽性 (ALK+) NSCLC 患者接受 ALK 酪氨酸激酶抑制劑 (ALK-TKI) 治療后臨床結局有所改善，這促使克唑替尼、色瑞替尼、阿來替尼、布格替尼和勞拉替尼等藥物獲得批準。在 ALK+ NSCLC 中已發(fā)現(xiàn) 90 多種不同的 ALK 融合變體。賊常見的變異是棘皮動物微管相關蛋白樣 4 (EML4)-ALK 變異 1 (V1)、變異 2 (V2) 以及變異 3a 和 3b (V3a/b)，它們是由 2 號染色體上與 ALK 融合的 EML4 在不同斷點處發(fā)生倒位引起的；這些變異的發(fā)生頻率分別為 42.7%、10.5% 和 37.1% 。

在先前的克唑替尼或勞拉替尼臨床研究中，V3a/b 患者的無進展生存期 (PFS) 似乎明顯短于 V1 患者。然而，這些結果與其他克唑替尼或阿來替尼研究的結果相沖突，這些研究報告稱 V1、V2 和 V3a/b 患者的 PFS 差異并不顯著。此外，目前可用的臨床數(shù)據(jù)非常有限，無法檢查次要罕見 ALK 變異（約占除 V1、V2 和 V3a/b 以外所有變異的 10%）是否影響對 ALK-TKI 的療效。

在這項臨床前研究中，腫瘤靶向藥物基因檢測分析了阿來替尼對主要 ALK 變異以及次要變異的影響。腫瘤靶向藥物基因檢測選擇了 ALK + NSCLC 中的八種不同的 ALK 融合變異：V1；V2；V3a；EML4-ALK 變異 4 (V4)；驅動蛋白家族成員 5 (KIF5B)-ALK；驅動蛋白輕鏈 1 (KLC1)-ALK；紋狀體、鈣調蛋白結合蛋白 (STRN)-ALK；和原肌球蛋白受體激酶融合基因 (TFG)-ALK。

阿來替尼抑制細胞內 ALK 變體的激酶活性

為了評估阿來替尼對 ALK 變體細胞內激酶活性的影響，腫瘤基因解碼基因檢測是通過將含有每種變體的載體單獨轉染到小鼠 Ba/F3 細胞系中，建立了八種穩(wěn)定細胞，每種細胞表達八種 ALK 變體中的一種。腫瘤基因解碼基因檢測是還通過轉染空載體建立了穩(wěn)定的對照細胞。由于載體中的新霉素抗性基因也由細胞中的組成型啟動子持續(xù)轉錄，因此新霉素抗性基因的 mRNA 表達水平被認為是估計轉染后每個 Ba/F3 細胞中載體和 ALK 變體基因拷貝數(shù)的良好標記。九種細胞之間的新霉素抗性基因 mRNA 水平差異不顯著，表明每種 ALK 變體的 mRNA 表達水平也幾乎相同。在所有八種 ALK 變體細胞中，阿來替尼均抑制了細胞內 ALK 變體及其下游信號傳導介質 STAT3 和 ERK 的磷酸化水平。此外，ULK1的Ser757磷酸化受到抑制，并且所有變異細胞中的MCL-1蛋白水平均被阿來替尼下調。ULK1 Ser757 磷酸化降低促進自噬，MCL-1 是抗凋亡的 Bcl-2 家族成員之一，這表明阿來替尼可在每種變異細胞中誘導自噬起始和凋亡，無論 ALK 變異類型如何。因此，不僅主要 ALK 變異體 V1、V2 和 V3a，而且次要變異體 V4、KIF5B-ALK、KLC1-ALK、STRN-ALK 和 TFG-ALK 都具有組成性激酶活性，從而通過 STAT3、ERK 或 ULK1 激活下游致癌信號傳導。然而，無論 ALK 變異類型如何，阿來替尼都可以通過抑制 ALK 磷酸化來抑制這些信號通路。

阿來替尼抑制 ALK 變異細胞的增殖

賊后，腫瘤基因解碼基因檢測是研究了阿來替尼對表達 ALK 變體的 Ba/F3 細胞生長的影響。阿來替尼治療 4 天后，這些表達 ALK 變體的細胞的增殖以劑量依賴性方式顯著受到抑制，它們的IC 50值沒有顯著差異，響應性差異<3.6倍。在賊大劑量1000 nM阿來替尼下，對照細胞的增殖抑制率不足40%。腫瘤基因解碼基因檢測是通過使用雙熒光染料染色吖啶橙和 DAPI 直接計數(shù)活細胞和非活細胞的數(shù)量來研究細胞死亡。用 10 nM 的阿來替尼處理 4 天后，所有變體細胞的細胞死亡率沒有顯著差異。與阿來替尼一樣，克唑替尼治療 4 天也以劑量依賴性方式顯著抑制每種 ALK 變體的細胞增殖, 且它們之間的IC 50值沒有顯著差異。接下來，腫瘤基因解碼基因檢測是研究了在半固體瓊脂培養(yǎng)基中用阿來替尼預處理 24 小時對 6 天培養(yǎng)中菌落形成的影響。V1、V2、V4、KLC1-ALK、STRN-ALK 變體細胞的每個菌落均被用阿來替尼預處理有效阻斷。無論是否接受阿來替尼預處理，V3a、KIF5B-ALK、TFG-ALK 變異細胞中均無菌落。這些結果表明，無論 ALK 變異類型如何，所有八種 ALK 變異表達細胞的細胞生長均會立即受到 ALK-TKI 治療的抑制，且抑制效果相似。

阿來替尼抑制對具有特定基因突變的腫瘤細胞的使用效果總結

腫瘤基因解碼基因檢測是發(fā)現(xiàn) ALK 融合變體的類型（V1、V2、V3a、V4、KIF5B-ALK、KLC1-ALK、STRN-ALK 或 TFG-ALK）不會影響 ALK 變體轉化的 Ba/F3 細胞的阿來替尼敏感性，IC 50值表明所有變體之間的反應性差異并不顯著，<3.6 倍。

先前有兩項研究使用細胞增殖測定法對與腫瘤基因解碼基因檢測是研究相同的 Ba/F3 細胞進行研究，但結果不一致。Heuckmann等人報道，表達 V3a 的細胞的 IC 50比表達 V2 的細胞高 6.7 倍以上 ；Woo等人報道，表達 V3a 的細胞的 IC 50比表達 V1 或 V2 的細胞高 11.8 倍以上，這表明表達 V3a 的細胞對阿來替尼的耐藥性比表達 V1 或 V2 的細胞更強。雖然造成這種矛盾的具體原因尚不清楚，但考慮到據(jù)報道ALK融合基因的擴增會在 ALK + H2228 細胞中誘導克唑替尼耐藥性，結果可能受到每種 ALK 變體基因表達水平差異的影響。此外，V1、V2 和 V3a 變體之間的周轉率以及細胞內 ALK 融合蛋白的不穩(wěn)定性也可能存在顯著差異。

因此，為了更正確地闡明阿來替尼敏感性的差異，腫瘤基因解碼基因檢測是認為不僅需要調整每種 ALK 變體蛋白的水平，還需要調整所有八種 ALK 變體表達細胞的基因表達水平。在本研究中，腫瘤基因解碼基因檢測是同時將每種變體電穿孔到 Ba/F3 細胞中，并成功制備了八種 ALK 變體表達細胞，通過測量新霉素抗性基因的表達來估計，它們之間每種 ALK 變體基因的表達量沒有顯著差異。如果每種變體的表達水平嚴重不平衡，則可能推斷出高表達的變體對阿來替尼的敏感性低于低表達的變體，無論 ALK 變體的類型如何。這一假設可能部分解釋了他們的結果與腫瘤基因解碼基因檢測是在 V1、V2 和 V3 對阿來替尼的反應方面的不一致。然而，腫瘤基因解碼基因檢測是的體外模型結果顯示，V1、V2 和 V3a 等 8 種 ALK 變異體對阿來替尼的敏感性無顯著差異，這與賊近一項阿來替尼一線治療的 III 期試驗中觀察到的臨床反應一致，該試驗發(fā)現(xiàn) V1、V2 或 V3a/b 變異體患者之間的客觀緩解率沒有顯著差異。

在ALK+ NSCLC患者中，已鑒定出近90種ALK融合變異體，除主要的V1、V2和V3a/b變異體之外，幾乎所有變異體對艾樂替尼的臨床反應尚不清楚。約17%的ALK+ NSCLC患者對艾樂替尼無反應，其反應不佳的原因也不明。在目前的臨床前研究中，不僅三種主要變異體對艾樂替尼或克唑替尼敏感性無顯著影響，五種不常見變異體（V4、KIF5B-ALK、KLC1-ALK、STRN-ALK和TFG-ALK）對艾樂替尼或克唑替尼敏感性亦無顯著影響。因此，這五種變異至少可能不會導致 ALK + NSCLC 患者對阿來替尼的臨床反應出現(xiàn)任何差異，并且在腫瘤基因解碼基因檢測是推測臨床反應和 ALK 變異之間的任何相關性之前，還需要對除此處測試的八種類型之外的各種 ALK 變異表達細胞進行進一步研究。

腫瘤基因解碼基因檢測是的研究有幾個局限性。首先，ALK 變體的數(shù)量有限。由于實驗上很難建立大量表達幾乎等同的 ALK 變體的 Ba/F3 細胞，因此腫瘤基因解碼基因檢測是在本研究中選擇了八種 ALK 變體。其次，腫瘤基因解碼基因檢測是沒有直接測量細胞中的 ALK 變體基因表達，因為每種 ALK 變體 mRNA 的穩(wěn)定性未知。然而，由相同組成型啟動子驅動的新霉素抗性基因存在于八個 ALK 變體載體中的每一個中。因此，腫瘤基因解碼基因檢測是通過測量常見新霉素抗性基因的表達水平間接衡量了每個 ALK 變體基因的表達。第三，腫瘤基因解碼基因檢測是用小鼠細胞系 Ba/F3 而非人類細胞系構建了表達 ALK 變體的細胞，盡管腫瘤基因解碼基因檢測是認為 Ba/F3 細胞適合本研究，因為它們已在之前的研究中用于檢查融合基因激酶活性，例如 ALK 或 ROS1 或 RET。為了克服這些限制，并在體外繪制出所有 ALK 融合變體對阿來替尼敏感性的完整圖譜，使用 Ba/F3 細胞和人肺上皮 BEAS-2B 細胞測試盡可能多的 ALK 變體將會很有用。

總之，八種 ALK 變異體（V1、V2、V3、V4、KIF5B-ALK、KLC1-ALK、STRN-ALK 和 TFG-ALK）的激酶活性被阿來替尼顯著抑制，表達每種變異體的細胞對阿來替尼治療的敏感性沒有顯著差異。腫瘤基因解碼基因檢測是的研究結果表明，無論 ALK 變異體的類型如何，攜帶這八種 ALK 融合變異體之一的 NSCLC 患者對阿來替尼的反應也可能相似，并且這些變異體的差異可能對 ALK 融合陽性 NSCLC 患者的阿來替尼反應影響不大。此外，由于臨床上僅檢測到非常有限數(shù)量的罕見 ALK 融合變異體，腫瘤基因解碼基因檢測是在本研究中構建的臨床前模型可能是研究這些次要變異體對阿來替尼治療的臨床反應的有用工具。