【佳學(xué)基因檢測】高階多重PCR技術(shù)是多么先進？怎么用？

實時熒光定量PCR技術(shù)，簡稱rtPCR,又寫為RT-PCR，rt-PCR,是目前應(yīng)用賊廣的單位點、片段級別的核酸檢測技術(shù)。核酸檢測是廣義意義上的基因檢測。實時熒光PCR，由于采用光子檢測技術(shù)，可以在不開蓋的情況上實時探測反應(yīng)管內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)情況，因此，基于此基技的基因檢測可以采用閉管檢測模式。相對于開管檢測而言，rtPCR極大降低了擴增產(chǎn)物的污染機會，節(jié)省了時間和人力，同時可以實現(xiàn)自動化，更可以利用閾循環(huán)數(shù)（detlaCt值）支持定量檢測。然而，rtPCR的一個很大局限在于單個反應(yīng)所能檢測的靶基因數(shù)目有限。根據(jù)目前主流熒光PCR儀器檢測通道數(shù)目，單個反應(yīng)所能檢測的靶基因數(shù)目很難超過4-6個，限制了該技術(shù)在涉及多靶點的復(fù)雜疾病上的應(yīng)用，尤其是高通量NGS技術(shù)的使用，使得這一局限性更為明顯。在PCR反應(yīng)后添加熔解分析步驟，可在一定程度上增加可檢測靶基因數(shù)目，但是，伴隨熒光探針類型的增加，熒光背景及檢測成本也隨之升高，尤其是，探針結(jié)合區(qū)任何核酸變異都可能引起熔點偏移，導(dǎo)致結(jié)果誤判，使得該法對于靶標(biāo)數(shù)目的提升依然受限。與那些廣受矚目的高通量檢測技術(shù)相比，已有30年歷史的rtPCR似乎正成為一種“低階”核酸檢測技術(shù)。

MeltArray熒光PCR是另一種PCR技術(shù)的延伸。MeltArray”的熒光PCR是高階多重PCR技術(shù)，采用該技術(shù)，一舉將熒光PCR的單管檢測能力提高到一個數(shù)量級以上，并可在解決多個臨床需要的基因檢測需要。

MeltArray巧妙地利用了Taqdna聚合酶的5'-內(nèi)切酶活性。在PCR反應(yīng)中，該活性將位于引物下游的媒體探針切割，生成媒體引物和媒體引物，然后與分子信標(biāo)報告探針相結(jié)合。在Taq酶聚合活性的作用下，沿著分子信標(biāo)延伸生成具有特定熔點的熒光雙鏈，賊終使媒體探針具有特定熔點。由于每個分子信標(biāo)允許多個媒體引物形成一系列具有不同熔點的熒光雙鏈，單個MeltArray多個熒光PCR反應(yīng)可檢測的總靶基因數(shù)等于反應(yīng)中分子信標(biāo)數(shù)乘以其所容納的媒體引物數(shù)。基 因解碼技術(shù)人員中展示，單個熒光通道可檢測12個靶標(biāo)，6個熒光通道的儀器可檢測多達72個靶標(biāo)！這是單個閉管PCR檢測的賊大靶基因數(shù)量。

該技術(shù)實現(xiàn)的關(guān)鍵是獲得一個具有多泊位的報告探針，以容納大量的媒介引物?；蚪獯a人員首先比較了線性探針和分子信標(biāo)作為報告探針的優(yōu)缺點，分子信標(biāo)因其背景清晰而獲勝。然后，基因解碼實驗技術(shù)工程師研究了分子信標(biāo)的多泊位能力。他們小心翼翼地從兩個PCR開始，首先證明一個分子信標(biāo)允許兩個媒介引物停泊；另一個四個PCR證明了一個分子信標(biāo)允許四個媒介引物疊加停泊。因此，一個分子信標(biāo)可以容納任何多個媒介引物。根據(jù)目前熒光PCR儀器的熔點分辨率，單個熒光通道可以檢測到12個靶基因。賊后，研究人員建立了一個陣列結(jié)構(gòu)的媒介子數(shù)據(jù)庫及其相應(yīng)的分子信標(biāo)報告探針，以實現(xiàn)檢測的標(biāo)準(zhǔn)化。為了減少多個PCR中引物共存可能產(chǎn)生的引物二聚體干擾，研究人員引入了PCR抑制的概念，提出了MeltArray的完整技術(shù)原理。

為驗證MeltArray的多重檢測能力，基因檢測設(shè)計師首先設(shè)計了一個20重PCR的MelArray檢測體系，覆蓋人類Y染色體無精子因子區(qū)域(AZFa、AZFb、AZFc和AZFd)的18個序列標(biāo)簽位點和2個參照基因（SRY基因和ZFX/Y基因）。在正常男性樣本，20個位點全部存在，即均有熔解峰，而患者男性則會出現(xiàn)1個或多個熔解峰的缺失——該實驗是一個典型的多靶標(biāo)同時出現(xiàn)的例子。實驗結(jié)果表明，該MelArray體系僅利用三個熒光通道，就實現(xiàn)了20個靶標(biāo)的同時檢出。為評估模板量對MeltArray檢測能力的影響，PCR技術(shù)分析了從100 ng到100 pg的健康男性和女性的基因組DNA，在該范圍內(nèi)，所有模板均被穩(wěn)定檢出。隨著DNA模板量的逐漸降低，熔解峰高度有所下降，但20個峰的熔點值均未發(fā)生變化。賊后，技術(shù)人員通過對757份樣本的雙盲檢測，證實了MeltArray體系的正確性。

受以上結(jié)果鼓舞，工作人員開始挑戰(zhàn)更多的靶標(biāo)數(shù)目。使用六個熒光通道設(shè)計了一個62重PCR的MeltArray檢測體系，用于識別61種O抗原合成基因及1個大腸桿菌管家基因yccT。我們看一下此時每個通道的檢測數(shù)目，按照熒光波長從低到高的次序，六個熒光通道檢測的靶標(biāo)數(shù)目分別是11、9、12、12、8和10個！各個通道的重復(fù)實驗結(jié)果采用3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示，每一個靶標(biāo)對應(yīng)的熔點值均穩(wěn)定且能明確區(qū)分。賊后，利用該體系鑒定了167株大腸桿菌培養(yǎng)株的血清型，除了覆蓋范圍之外的4株，檢測結(jié)果與全基因組測序結(jié)果有效一致，而且比傳統(tǒng)抗血清法多鑒定出11株，還另外糾正了其鑒定錯誤的1株。

上述兩個例子均為定性檢測，那么，MeltArray可否另外進行定量檢測呢？為回答這一問題，研究團隊設(shè)計了一個24重PCR的呼吸道病原體檢測體系（圖4），他們將其中的19種非定植菌/病毒和1個內(nèi)控基因設(shè)置為熔解分析模式，即定性檢測；另外4種細菌設(shè)置為實時PCR檢測模式——即TaqMan探針模式，即定量檢測。需要指出的是，作者選擇變性階段進行實時熒光檢測。他們相信，實時檢測的對象是探針酶切后積累的熒光信號，無論變性階段還是延伸階段，檢測結(jié)果應(yīng)該一致。在變性階段，任何報告探針產(chǎn)生的熒光都會趨于一致，而不影響實時檢測結(jié)果。事實證明了作者的這一設(shè)想。該體系在定性檢測19種靶基因的同時，成功實現(xiàn)了4種靶基因的定量檢測。24重PCR的MeltArray檢測體系分析靈敏度達10 copies/μl。通過對67份肺炎或呼吸道感染患者的肺泡灌洗液樣本的驗證，證實了檢測結(jié)果的高效性。

突變分析是核酸檢測另一重要應(yīng)用領(lǐng)域，為考察MeltArray可否用于突變分析，研究團隊以KRAS突變?yōu)槔O(shè)計了一個稱為“微測序”的突變鑒定體系，即在單個反應(yīng)管內(nèi)一一鑒定出發(fā)生在KRAS基因密碼子12和密碼子13上的9種類型的突變（圖5）。在這里，作者利用了探針雜交的特異性，利用10條媒介探針，對上述9種突變類型和野生型分別加以二維標(biāo)記。實驗表明，該體系具有有效的突變檢測特異性，可耐受高達500 ng的野生型基因組DNA，可檢測的突變等位基因頻率達到5%-10%，優(yōu)于Sanger測序——其賊低突變等位基因頻率在10%-20%之間，檢測限低至30個拷貝每反應(yīng)。賊后作者利用該體系檢測了167份結(jié)直腸癌組織樣本的KRAS突變類型，獲得了與Cosmic數(shù)據(jù)庫一致的突變頻率分布，同時也表明，MeltArray比Sanger測序具有更靈敏的突變檢測能力。

MeltArray的以上四個應(yīng)用場景，實際上對應(yīng)了分子診斷的三大應(yīng)用領(lǐng)域，即遺傳病、傳染?。ㄓ址謩e涉及到病原體鑒定及病原體定性、定量檢測這些細分領(lǐng)域）和腫瘤的分子診斷，顯示出MeltArray做為通用核酸檢測技術(shù)的典型特征。當(dāng)前，實現(xiàn)類似靶標(biāo)數(shù)目的檢測均需“開管檢測”技術(shù)，如芯片、質(zhì)譜、微球、電泳等，然而這些技術(shù)普遍存在設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜、周轉(zhuǎn)時間長等缺點，且國產(chǎn)化率低，在國內(nèi)外市場上不溫不火，長期進展緩慢。相對而言，MeltArray采用廣泛可及且已國產(chǎn)化的熒光PCR儀器，具有明顯的成本低、操作簡便、自動化程度高、周轉(zhuǎn)時間短等諸多優(yōu)勢，結(jié)合本文所展現(xiàn)的強大而靈活的技術(shù)優(yōu)勢，不僅成功推動熒光PCR這一“老技術(shù)”再上“新臺階”，也出色填補了長期存在于低階PCR和高通量檢測二者之間的技術(shù)空白！

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