【佳學(xué)基因檢測(cè)】基因檢測(cè)技術(shù)之多重PCR技術(shù)
01
多重?zé)晒舛?PCR 技術(shù)
1.1 基于熒光探針的多重 PCR 技術(shù)
多重?zé)晒舛?PCR (Multiple fluorescencequantitative PCR)技術(shù)是在熒光定量 PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，利用幾種不同熒光基團(tuán)的組合，結(jié)合儀器對(duì)不同通道熒光的檢測(cè)能力實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)靶標(biāo)的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。
TaqMan 水解探針 (Hydrolysisprobes) 是多重?zé)晒?PCR 體系中常用的一種探針，探針一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，通過在不同序列末端標(biāo)記不同熒光基團(tuán)及相應(yīng)的淬滅基團(tuán)，即可形成不同的 TaqMan 水解探針，將上述探針及相應(yīng)的擴(kuò)增引物加至同一反應(yīng)體系，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)靶標(biāo)的共同檢測(cè)。
Weller等 [7] 以 TaqMan 探針為基礎(chǔ)，成功構(gòu)建了兩重 PCR擴(kuò)增和檢測(cè)體系，Zhang 等 [8] 通過單管逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)腸病毒 71 型 (EV71)、柯薩奇病毒 A16 (CA16) 以及總腸道病毒 (EVs) 的三重檢測(cè)。
分子信標(biāo) (Molecular beacon) 是多重 PCR 體系中另一種常用的探針，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET) 的原理，當(dāng)體系中不存在特異性的靶標(biāo)時(shí)，分子信標(biāo)會(huì)自發(fā)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)相互接近從而發(fā)生 FRET，不會(huì)產(chǎn)生熒光。
如果體系中存在特異性的靶標(biāo)，在一定的條件下，莖環(huán)結(jié)構(gòu)會(huì)打開并且與靶標(biāo)進(jìn)行復(fù)性，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。那么在同一個(gè)反應(yīng)體系中加入幾種靶標(biāo)特異性的分子信標(biāo)就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多個(gè)靶標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)。Vet 等 [9] 針對(duì) 4 種不同的靶標(biāo)設(shè)計(jì)了 4 種不同的分子信標(biāo)并且新穎在四色熒光 PCR 儀上實(shí)現(xiàn)了四重的檢測(cè)，El-Hajj 等 [10] 利用五色分子信標(biāo)探針實(shí)現(xiàn)了對(duì)結(jié)核桿菌利福平耐藥突變的檢測(cè)。
1.2 基于探針編碼的多重 PCR 技術(shù)
基于水解探針和分子信標(biāo)探針的多重?zé)晒舛?PCR 技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便快捷，然而受儀器熒光檢測(cè)通道的限制，往往賊多只能達(dá)到四重或五重檢測(cè)。
組合探針編碼 (Combination probecoding) 技術(shù)的開發(fā)，使得目前的多重實(shí)時(shí)核酸擴(kuò)增可檢測(cè)的靶標(biāo)數(shù)目多于儀器可檢測(cè)的數(shù)目。通過對(duì) 4 種不同的熒光基團(tuán)進(jìn)行相互組合可以形成15 種指示探針 (圖 1)，在多重反應(yīng)體系中加入多種靶序列特異的置換探針 (Displacing probes)，那么在檢測(cè)通道有限的情況下仍能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多種不同的靶標(biāo)同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。
Huang 等利用多色組合探針編碼技術(shù) (MCPC) 實(shí)現(xiàn)了對(duì) 8 種食源性病原菌的鑒定以及通過 4 色組合探針編碼技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì) 15 種不同型別的 HPV 病毒進(jìn)行分型 [11-12] 。
1.3 基于熒光染料的多重 PCR 技術(shù)
非特異性的熒光染料嵌入到 DNA 雙鏈小溝中后，在特定的激發(fā)光激發(fā)后將會(huì)產(chǎn)生一定波長的熒光。
以此為基礎(chǔ)發(fā)展了熔解曲線 (Meltingcurve) 分析法，利用不同 DNA 序列具有不同 Tm(Melting temperature) 值的特征，在 PCR 反應(yīng)結(jié)束后，通過程序升溫使雙鏈逐漸解鏈成單鏈，當(dāng)達(dá)到雙鏈特異的 Tm 值所對(duì)應(yīng)的溫度時(shí)，熒光強(qiáng)度大幅度降低，利用這樣的原理可以對(duì) PCR 中不同長度的雙鏈產(chǎn)物或相同長度不同 GC 含量的雙鏈進(jìn)行分析 (圖 2)。
Singh 等 [13] 利用多重實(shí)時(shí)PCR 熔解曲線分析的方法，成功地實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)氨芐西林、鏈霉素、磺胺、四環(huán)素、氯霉素耐藥的沙門氏菌的檢測(cè)與辨別，Mendes 等 [14] 建立了一種多重熔解曲線分析方法并且實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同基因編碼的金屬-β-內(nèi)酰胺酶型別的檢測(cè)和鑒別。
針對(duì)不同的型別設(shè)計(jì)了特異性的引物對(duì)，從而對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增生成不同的擴(kuò)增子，擴(kuò)增子之間T m 值各有差異，賊后通過熔解曲線峰的位置進(jìn)行鑒別。
在熔解曲線分析技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的高分辨率熔解曲線技術(shù)是一種利用飽和染料，借助高分辨率的儀器，實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)核苷酸熔解溫度不同從而形成不同形態(tài)熔解曲線，進(jìn)而對(duì)基因進(jìn)行分析的新技術(shù)，它具有極高的靈敏度，能夠檢測(cè)出單個(gè)堿基之間的差別，目前主要應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性分析、甲基化分析、基因突變、基因分型等領(lǐng)域 [15-18] 。
1.4 基于熒光探針熔解曲線的多重 PCR 技術(shù)
由于熒光基團(tuán)本身發(fā)射的不是單一波長的熒光，而且 PCR 儀對(duì)不同熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)的區(qū)分度有限，所以現(xiàn)有的 PCR 儀只能檢測(cè) 4–5 種不同的熒光信號(hào)。
而基于熒光染料的多重 PCR 技術(shù)由于染料不具備特異性的識(shí)別能力，所以同一反應(yīng)體系中通常只能使用一種熒光染料。為了彌補(bǔ)這兩種方法的不足而開發(fā)出來的熒光探針熔解曲線技術(shù) (Fluorescence probe melting curve technique)具有成本低、多重檢測(cè)能力更強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
通過在靶序列中選取相對(duì)保守的區(qū)域設(shè)計(jì)通用擴(kuò)增引物，然后在引物對(duì)之間選取差異度較大的區(qū)域設(shè)計(jì)能夠識(shí)別各種目標(biāo)核酸序列的特異性探針，探針在擴(kuò)增的過程中不會(huì)被有效水解，并且根據(jù)檢測(cè)通道的不同將探針進(jìn)行分組，每個(gè)通道中包含多個(gè)特異性探針，通過調(diào)整探針的長度或 GC 含量對(duì)每條探針的 T m 值進(jìn)行人為的調(diào)控，使得同一檢測(cè)通道內(nèi)針對(duì)不同靶標(biāo)的檢測(cè)探針 T m 值都間隔合適的差值，每個(gè)熒光通道均可定性檢測(cè)多個(gè) 靶 標(biāo) ， 賊 后 通 過 熔 解 曲 線 進(jìn) 行 分 析 。
Elenitoba-Johnson 等 [19] 利用熒光探針熔解曲線技術(shù)成功地區(qū)分了 27 種可能發(fā)生堿基替換的序列。Liao等 [20] 利用熒光探針熔解曲線技術(shù)成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì) 15 種高危型 HPV 的分型以及實(shí)現(xiàn)了對(duì) 48 種人類單核苷酸多態(tài)性的分型和分析。
02
多重?zé)晒舛?PCR 技術(shù)需將多個(gè)引物對(duì)、探針以及模板加入到同一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行反應(yīng)，伴隨檢測(cè)重?cái)?shù)的增加，同管內(nèi)核苷酸鏈數(shù)目也會(huì)增加，各核苷酸鏈之間互搭形成二聚體甚至多聚體的可能性大幅上升，輕則導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)，靶標(biāo)擴(kuò)增效率下降，檢測(cè)靈敏度和特異性降低，重則導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增占據(jù)主導(dǎo)，靶標(biāo)擴(kuò)增失敗，造成檢測(cè)結(jié)果假陽性和/或假陰性。
基于微流控芯片 (Microfluidic chip) 的多重 PCR 技術(shù)通過在芯片微孔中預(yù)裝填不同的引物對(duì)的方法將各重?cái)U(kuò)增限制在各自的獨(dú)立空間內(nèi)，再通過液流控制系統(tǒng)將模板引流到不同的微孔中，進(jìn)而在微孔中進(jìn)行特異的 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，賊后再進(jìn)行終點(diǎn)定性檢測(cè) (圖 3) [21] ，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)靶標(biāo)的區(qū)分和鑒別 [21-24] 。
Poritz 等結(jié)合微流控技術(shù)研發(fā)了一種可以同時(shí)檢測(cè)多種病原體的診斷平臺(tái)，稱為“FilmArray”，該平臺(tái)成功地實(shí)現(xiàn)了在 1 h 內(nèi)對(duì) 21 種常見的病毒或細(xì)菌的檢測(cè)和鑒別 [25-27] 。
Cai 等 [28] 設(shè)計(jì)的一種微流控芯片利用雙向電泳技術(shù)和多重陣列 PCR 終點(diǎn)熒光檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在全血中對(duì)不同病原菌的即時(shí)檢測(cè)。多重液滴式數(shù)字 PCR 的作用原理與基于微流控芯片的多重PCR 的原理相似，通過芯片裝置和液流控制系統(tǒng)產(chǎn)生成千上萬個(gè)液滴，每個(gè)液滴中只包含單個(gè)目的 DNA 分子，這樣就可以使不同的靶標(biāo)處于相對(duì)獨(dú)立的空間進(jìn)行各自特異性的擴(kuò)增反應(yīng)，賊后通過計(jì)算各靶標(biāo)發(fā)生有效擴(kuò)增的液滴數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)先進(jìn)定量。
Jackson 等 [29] 利用液滴式數(shù)字 PCR成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)血液游離 DNA (Free DNA) 中罕見癌癥突變的多重檢測(cè)，利用液滴式數(shù)字 PCR 對(duì)珍貴的臨床標(biāo)本進(jìn)行多靶標(biāo)的檢測(cè)，極大地提高了標(biāo)本的利用率并降低了成本 [30-31] 。
基于微流控芯片的多重 PCR 技術(shù)和多重液滴式數(shù)字 PCR 的優(yōu)點(diǎn)是在一定程度上避免了非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的生成以及在熒光定量PCR的基礎(chǔ)上增加了檢測(cè)重?cái)?shù)。但是當(dāng)模板濃度較低時(shí)，基于微流控的方法將模板分流至含特異性引物微孔中的概率降低，易產(chǎn)生假陰性結(jié)果；而多重液滴式數(shù)字 PCR 的方法使每個(gè)液滴中僅包含單重引物和模板的概率相對(duì)較低，往往一個(gè)液滴中包含多對(duì)引物或者液滴中的引物與模板為非特異性配對(duì)，另外它對(duì)模板的要求較高，濃度過高的模板不能高效生成的每個(gè)液滴中僅包含單個(gè)目的 DNA 分子。
此外在檢測(cè)方面，上述兩種技術(shù)都需要配合擴(kuò)增的特殊性而使用到高精密度的檢測(cè)儀器，其技術(shù)的復(fù)雜性使其實(shí)現(xiàn)較為困難。
03
3.1 基于膜層析的多重檢測(cè)技術(shù)
膜層析技術(shù) (Membrane chromatography) 是在柱層析技術(shù)上發(fā)展而來的一項(xiàng)技術(shù)，以膜介質(zhì)為基質(zhì)，偶聯(lián)相應(yīng)的離子交換、親和、疏水等化學(xué)基團(tuán)，制作而成的一種新型的層析介質(zhì)。膜層析技術(shù)具有簡(jiǎn)單快速并且能夠自動(dòng)分離液體混合物的優(yōu)點(diǎn)，而多重 PCR 技術(shù)具有有效富集目的片段的優(yōu)點(diǎn)，將這兩種技術(shù)有機(jī)地結(jié)合在一起能夠形成一種靈敏度高、特異性好、成本低、簡(jiǎn)便快速的多重核酸檢測(cè)方法。
該方法提前將靶標(biāo)特異性的捕獲探針固定在層析膜的不同位置上，然后使變性后的多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過毛細(xì)作用經(jīng)過層析膜，固定在特定位置的捕獲探針通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的作用將末端帶有膠體金或熒光素的產(chǎn)物捕獲，而非特異的擴(kuò)增產(chǎn)物及引物被洗脫，賊后通過肉眼或熒光檢測(cè)儀對(duì)產(chǎn)生的熒光進(jìn)行檢測(cè)和識(shí)別 (圖 4) [32] 。
Mao 等 [33] 基于膠體金標(biāo)記的核酸探針和側(cè)流試紙條建立了一種現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)目的基因的方法，利用這種核酸層析金標(biāo)試紙條能夠在 15 min內(nèi)檢測(cè)出核酸樣本。Carter 等 [34] 發(fā)明的側(cè)流微陣列方法能夠快速、靈敏地對(duì)多種核酸進(jìn)行檢測(cè)，并且不需要專門的儀器設(shè)備，這種方法以微型側(cè)流設(shè)備為基礎(chǔ)，利用核酸雜交介導(dǎo)靶標(biāo)的捕獲。Gomez-Martinez等 [32] 開發(fā)的多重核酸檢測(cè)試紙條在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)現(xiàn)了對(duì) 108 例獻(xiàn)血者血型相關(guān)基因型的正確鑒定。
基于膜層析的多重檢測(cè)技術(shù)以其操作簡(jiǎn)單、攜帶便捷等優(yōu)點(diǎn)拓寬了可檢測(cè)的范圍，使檢測(cè)不再局限于實(shí)驗(yàn)室，對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)也能夠?qū)?/span>現(xiàn) [35-37] ，但是膜層析技術(shù)中樣品的阻滯、非特異性雜交等問題仍然是今后需要解決的問題。
3.2 基于 Luminex 液相芯片的多重檢測(cè)技術(shù)
液相芯片技術(shù) (Liquid chip technology) 被稱為后基因組時(shí)代的芯片技術(shù)，也被稱為 xMAP 技術(shù)。它可以同時(shí)對(duì) 1 份標(biāo)本中的 100 種不同目的分子進(jìn)行檢測(cè)，并能在 30 min 內(nèi)檢測(cè) 96 個(gè)不同的樣本。
其液相微球編碼原理為，將兩種熒光染料分別用 10 種不同的濃度兩兩混合形成 10×10的熒光配比陣列，并對(duì)微球進(jìn)行染色，得到 100 種不同熒光編碼的微球。將熒光編碼且共價(jià)結(jié)合了不同捕獲探針的微球懸浮于一個(gè)液相體系中，先加入待檢測(cè)分子與其反應(yīng)，再加入帶有熒光標(biāo)記的報(bào)告分子，從而形成“微球-捕獲探針-靶標(biāo)-報(bào)告分子”復(fù)合物。
檢測(cè)時(shí)，該復(fù)合物在鞘液的作用下將逐個(gè)通過檢測(cè)通道，接受兩束不同波長的激發(fā)光照射并對(duì)相應(yīng)的發(fā)射光進(jìn)行檢測(cè)，其中一束激光用于識(shí)別微球種類，即判定該種微球是對(duì)哪種特定的靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，另一束激光用于檢測(cè)微球上報(bào)告分子的熒光強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的定性和定量分析 (圖 5) [38] 。
Sherry 等 [39] 利用 Luminex液相芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)沙門氏菌和其他病原菌的檢測(cè)和鑒定。Rajeswari 等 [40] 利用 Luminex 液相芯片技術(shù)和液滴生成技術(shù)成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)禽流感病毒、傳染性猴氣管炎病毒和空腸彎曲菌的檢測(cè)和鑒別。Song 等 [41] 利用 Luminex 液相芯片技術(shù)同時(shí)對(duì) 11 種不同的突變型進(jìn)行檢測(cè)和分型。
雖然基于Luminex 液相芯片技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)對(duì)多種不同病原體的檢測(cè)和鑒別，但它僅在檢測(cè)方面發(fā)揮了其多通量、高效率的特性，其實(shí)質(zhì)上并沒有解決多重?cái)U(kuò)增中眾多引物、探針、模板間相互錯(cuò)配的問題。因此，未來開發(fā)出微球表面多重?cái)U(kuò)增以及Luminex 液相芯片檢測(cè)一體化的技術(shù)是核酸多重檢測(cè)的重要研究方向。
04
MPCR 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于它的高效性，通過一次擴(kuò)增反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原體進(jìn)行檢測(cè)和鑒別，相較多個(gè)單重檢測(cè)而言成本顯著降低。
MPCR 有著廣泛的應(yīng)用前景，但是仍然存在許多影響 MPCR 擴(kuò)增與檢測(cè)效果的因素 (表 1)，其中擴(kuò)增效率的一致性是賊大的難題，檢測(cè)重?cái)?shù)越多，效率一致性往往越低。針對(duì) MPCR 擴(kuò)增效率一致性的問題，傳統(tǒng)單管多靶標(biāo)擴(kuò)增的方式通過不斷優(yōu)化反應(yīng)體系中緩沖液、酶、引物、探針等的用量，確保每一重的擴(kuò)增效率保持一致，然而隨著檢測(cè)重?cái)?shù)的增加，形成二聚體甚至多聚體的可能性也大幅上升，輕則導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)，靶標(biāo)擴(kuò)增效率下降，檢測(cè)靈敏度和特異性降低，重則導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增占據(jù)主導(dǎo)，靶標(biāo)擴(kuò)增失敗，造成假陽性和/或假陰性，影響檢測(cè)正確性。
而基于微流控的 MPCR 則將每一重的擴(kuò)增分布在各自相對(duì)獨(dú)立的空間內(nèi)進(jìn)行，在一定程度上降低了引物二聚體的生成，高效了擴(kuò)增效率，但是微流控的實(shí)現(xiàn)相對(duì)較為困難，且當(dāng)模板濃度較低時(shí)，易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
相比于上述方法，基于固相載體表面擴(kuò)增的 MPCR 則將不同的引物對(duì)分配至不同的固相載體上，使得每個(gè)靶標(biāo)的擴(kuò)增集中于以特定固相顆粒為載體的表面，從根本上解決 MPCR 引物間相互干擾的問題，此外將固相載體表面擴(kuò)增與 Luminex 液相芯片檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合能夠同時(shí)對(duì)各固相顆粒及顆粒表面的擴(kuò)增信號(hào)進(jìn)行特異性識(shí)別，并且理論上能夠?qū)崿F(xiàn)100 重的核酸擴(kuò)增與檢測(cè)，極大地提高了檢測(cè)重?cái)?shù)的同時(shí)又能高效各靶標(biāo)的擴(kuò)增互不干擾，但是由于需要將引物束縛至固相載體，這在一定程度上限制了引物與模板的碰撞概率并且導(dǎo)致其擴(kuò)增效率降低，那么如何提高固相載體表面的擴(kuò)增效率值得深入思考。
針對(duì)上述問題，可通過將反應(yīng)體系分隔成微小液滴，或結(jié)合管式對(duì)流 PCR技術(shù)使反應(yīng)體系在擴(kuò)增的過程中循環(huán)流動(dòng)，將有望提高引物與模板之間碰撞的概率，同時(shí)提高固相載體表面的擴(kuò)增效率，從而開發(fā)出擴(kuò)增效率高、一致性好、體系穩(wěn)定、檢測(cè)重?cái)?shù)高的多重PCR 技術(shù)。
作者： 鐘澤澄1,2 ，王進(jìn) 2 ，張師音 1,2
機(jī)構(gòu)：
1 廈門大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，福建 廈門 361100
2 廈門大學(xué) 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361100
國家自然科學(xué)基金：(Nos. 81501835, 81871505)，福建省自然科學(xué)基金 (No. 2017J05136) 資助。
來源：生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(2): 171–179.
詳見：生物工程學(xué)報(bào)
(責(zé)任編輯：佳學(xué)基因)
