【佳學(xué)基因檢測(cè)】癌癥序列變異解釋與報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)指南：如何高效腫瘤基因檢測(cè)的正確性？
ASCO和CAP聯(lián)合推薦
肺癌基因檢測(cè)單位選擇標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)介
肺癌是中國先進(jìn)大發(fā)病率癌癥，佳學(xué)基因投入大量人力物力專注于良性、惡性腫瘤的產(chǎn)生原因、阻抑方式、靶向藥物及免疫藥物的選擇和使用方法。提出基因解碼是腫瘤早期預(yù)測(cè)、個(gè)性化治好的信息依據(jù)，并指出基因解碼解密基因序列變異與腫瘤診斷與治療的關(guān)系要優(yōu)先于基于數(shù)據(jù)庫比對(duì)的基因檢測(cè)。關(guān)于癌癥序列變異解釋與報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)是將整個(gè)行業(yè)推向正確方向的先進(jìn)步。
1. 引言
基于二代測(cè)序技術(shù)的腫瘤檢測(cè)已越來越多的應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室中，但目前在不同實(shí)驗(yàn)室間存在檢測(cè)方法、報(bào)告內(nèi)容等方面的差異，這對(duì)遺傳檢測(cè)的解讀以及普及應(yīng)用造成了一定的影響。因此，在不同實(shí)驗(yàn)室間建立統(tǒng)一的分子檢測(cè)結(jié)果的解讀和報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)，及建立行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，顯得尤為迫切。
在2015年春天，在美國專門成立了一個(gè)以臨床實(shí)驗(yàn)室為核心的工作組，其組成包含了分子病理協(xié)會(huì)(AMP)、美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)協(xié)會(huì)(ACMG)、美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)與美國病理學(xué)家協(xié)會(huì)(CAP)的一線專家，該工作組的主要工作為對(duì)腫瘤及疑似腫瘤相關(guān)的序列變異檢測(cè)建立檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)并在行業(yè)達(dá)成共識(shí)。
該工作組首先對(duì)北美地區(qū)超過40家的臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了問卷調(diào)查，結(jié)果顯示不同實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)組織類型、檢測(cè)基因數(shù)量、是否檢測(cè)腫瘤組織全外顯子組或全基因組、以及其他細(xì)節(jié)方面都存在較大差別，此外在不同單位的檢測(cè)報(bào)告的報(bào)告內(nèi)容方面也存在較多差異。該工作組認(rèn)為，為醫(yī)療機(jī)構(gòu)提供分類的遺傳變異報(bào)告對(duì)病人及整個(gè)醫(yī)療行業(yè)都極為重要，包括：提供正確的腫瘤對(duì)靶向治療反應(yīng)性信息；建立先進(jìn)別的醫(yī)療指南；以及與臨床試驗(yàn)合作，對(duì)建立不同實(shí)驗(yàn)室間的通用標(biāo)準(zhǔn)提供支持?；谝陨线@些考量，工作組專家們根據(jù)已有數(shù)據(jù)、文獻(xiàn)報(bào)道和專業(yè)知識(shí)，給出以下指南建議。
圖1 AMP對(duì)NGS技術(shù)及NGS結(jié)果解讀的調(diào)研
圖注：
A: MAF閾值；B: 變異分類數(shù)目；C:報(bào)告中是否包含治療性建議；D: 報(bào)告中是否包含潛在的生殖細(xì)胞突變；
E: 報(bào)告是否包含變異等位頻率Variant allele frequency (VAF)；F: 報(bào)告是否包含基因組坐標(biāo)；
G: 報(bào)告是否包含轉(zhuǎn)錄本ID(Transcript accession)；H: 報(bào)告是否包含不符合質(zhì)控的基因/區(qū)間。
2. 術(shù)語
dbSNP, The Database of Short Genetic Variation;
ExAC, Exome Aggregation Consortium;
IARC, International Agency for Research on Cancer;
NCBI, National Center for Biotechnology Information;
SNV, single-nucleotide variant;
UCSC, University of California, Santa Cruz;
WHO, World Health Organization;
FDA, Food and Drug Administration;
CNV, copy number variation;
COSMIC, Catalog of Somatic Mutations in Cancer;
HGMD, Human Gene Mutation Database;
indel, insertion and deletion;
LOF, loss of function;
MAF, minor allele frequency;
PG, professional guideline;
TCGA, The Cancer Genome Atlas;
VAF, variant allele frequency.
3. 數(shù)據(jù)庫
3.1 基因組數(shù)據(jù)庫
3.1.1 大型腫瘤基因組數(shù)據(jù)庫
1. The National Cancer Institute’s Genome Data Commons：
- The Cancer Genome Atlas(TCGA)
- Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Therapies(TARGET)
- the Cancer Genome Characterization Initiative
2. Catalog of Somatic Mutations in Cancer
3.1.2 體細(xì)胞序列變異解釋相關(guān)數(shù)據(jù)庫
表1 體細(xì)胞序列變異解釋相關(guān)數(shù)據(jù)庫
| Utility/function | Database | Location (web address) |
| Population databases to exclude polymorphisms | √1000 Genomes Project16√ | http://browser.1000genomes.org |
| Exome Variant Server | http://evs.gs.washington.edu/EVS | |
| √dbSNP17√ | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp | |
| dbVar18√ | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbvar | |
| ExAC√ | http://exac.broadinstitute.org | |
| Cancer-specific variant databases | √Catalog of Somatic Mutations in Cancer19√ | http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic |
| My Cancer Genome | http://www.mycancergenome.org | |
| Personalized cancer therapy, MD Anderson Cancer Center | https://pct.mdanderson.org | |
| cBioPortal, Memorial Sloan Kettering Cancer Center20 | http://www.cbioportal.org | |
| Intogen21 | https://www.intogen.org/search | |
| ClinicalTrials.gov | https://clinicaltrials.gov | |
| IARC (WHO) TP53 mutation database22 | http://p53.iarc.fr | |
| Pediatric Cancer Genome Project (St. Jude Children’s Research Hospital–Washington University) | http://explorepcgp.org | |
| International Cancer Genome Consortium23√ | https://dcc.icgc.org | |
| Sequence repositories and data hosts | NCBI Genome | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome |
| RefSeqGene24 | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/rsg | |
| Locus Reference Genomic25 | http://www.lrg-sequence.org | |
| UCSC table browser26 | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables | |
| Ensemble BioMart27√ | http://useast.ensembl.org/biomart/martview | |
| Other disease/mutation databases useful in the context of variant interpretation for cancer genomics | √ClinVar28√ | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar |
| √Human Gene Mutation Database29√ | http://www.hgmd.org | |
| Leiden Open Variation Database30 | http://www.lovd.nl | |
| dbNSFP (compiled database of precomputed in silico prediction scores for nonsynonymous SNVs)31√ | https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP | |
| Ensemble Variant Effect Predictor15 | http://www.ensembl.org/info/docs/tools/vep/index.html |
表注：
表格為不有效統(tǒng)計(jì)，賊后更新日期2016年6月7日。
3.1.3 臨床實(shí)驗(yàn)室在應(yīng)用公共數(shù)據(jù)庫時(shí)一般的注意事項(xiàng)
1. 了解數(shù)據(jù)庫內(nèi)容及數(shù)據(jù)組織形式；
2. 特別注意數(shù)據(jù)庫的限制，避免檢測(cè)結(jié)果過度解讀；
3. 注意基因組與轉(zhuǎn)錄組的組裝版本，應(yīng)與Human Genome Variation Society (HGVS)注釋一致；
4. 根據(jù)已有資源評(píng)估基因組測(cè)序質(zhì)量；
5. 確認(rèn)用于病理診斷的數(shù)據(jù)質(zhì)量。
3.2 參考序列數(shù)據(jù)庫
常見參考序列數(shù)據(jù)庫用于人類基因組組裝及相關(guān)信息，包括基因組坐標(biāo)，轉(zhuǎn)錄本編號(hào)與版本，外顯子邊界等等。常見的有：
- √RefSeq (National Center for Biotechnology Information Reference Sequence Database,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq, last accessed January 2, 2016),
- √Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html, last accessed January 2, 2016),
- Locus Reference Genomic (https://www.lrg-sequence.org,last accessed February 2, 2016)
3.3 人群數(shù)據(jù)庫
人群數(shù)據(jù)庫提供基因多態(tài)性、人群等位基因頻率等信息，用于區(qū)分測(cè)序結(jié)果中的多態(tài)性與突變，常見的有：
- The Database of Short Genetic Variation (the National Center for Biotechnology Information database of genetic variation)
- Exome Variant Server
- √Exome Aggregation Consortium
3.4 腫瘤特異性數(shù)據(jù)庫
腫瘤特異性數(shù)據(jù)庫提供匯總之后的不同腫瘤類型及亞型間的序列變異發(fā)生率，還包括發(fā)表的文獻(xiàn)、臨床試驗(yàn)、成果數(shù)據(jù)等數(shù)據(jù)，見表1 Cancer-specific variant databases。
3.5 原發(fā)性變異數(shù)據(jù)庫
原發(fā)性變異數(shù)據(jù)庫（Constitutional Variant Databases）主要用于區(qū)分生殖系變異與體細(xì)胞變異，常用的有:
- √Human Gene Mutation Database
- √ClinVar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)
3.6 內(nèi)部數(shù)據(jù)庫（實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生）
臨床實(shí)驗(yàn)室根據(jù)內(nèi)部資源獨(dú)立建立的數(shù)據(jù)庫，可用于變異注釋，指南鼓勵(lì)將這些體細(xì)胞變異的注釋數(shù)據(jù)逐步整合到公共數(shù)據(jù)庫資源中去促進(jìn)體細(xì)胞變異的解釋。
4. 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)算法
生物信息學(xué)預(yù)測(cè)算法常用于預(yù)測(cè)基因中核苷酸的變化是否會(huì)影響基因的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的功能，總體上看，目前的生物信息學(xué)算法還無法高效足夠高的特異性（大約60%-80%），因此建議不要將預(yù)測(cè)結(jié)果作為臨床分類與臨床決策的證據(jù)。
表2 預(yù)測(cè)序列突變對(duì)基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能影響的算法
| Utilsity/function | Algorithm/software | Location (web address) |
| Missense SNV | √PolyPhen237√ | http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2 |
| √SIFT38√ | http://sift.jcvi.org | |
| MutationAssessor39√ | http://mutationassessor.org | |
| MutationTaster41√ | http://www.mutationtaster.org | |
| PROVEAN45 | http://provean.jcvi.org/index.php | |
| Condel46 | http://bg.upf.edu/blog/2012/12/condel-for-prioritization-of-variants-involved-in-hereditary-diseases-and-transfic-for-cancer | |
| CoVEC40 | https://sourceforge.net/projects/covec/files | |
| CADD47√ | http://cadd.gs.washington.edu | |
| GERP++48√ | http://mendel.stanford.edu/sidowlab/downloads/gerp/index.html | |
| PhyloP and PhastCons49√ | http://compgen.bscb.cornell.edu/phast | |
| Splice site prediction | Human Splicing Finder42 | http://www.umd.be/HSF3 |
| MaxEntScan43 | http://genes.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscan_scoreseq.html | |
| NetGene244 | http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2 | |
| NNSplice50 | http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html | |
| GeneSplicer51 | http://www.cbcb.umd.edu/software/GeneSplicer/gene_spl.shtml |
表注：
表格為不有效統(tǒng)計(jì)，賊后更新日期2016年6月7日。
5. 變異鑒定與注釋
通常由軟件來鑒定和注釋變異，比如點(diǎn)突變、插入缺失、結(jié)構(gòu)變異和拷貝數(shù)變異。臨床實(shí)驗(yàn)室需注意軟件工具的局限性。測(cè)序深度、等位基因頻率等信息需加以考慮，在腫瘤異質(zhì)性評(píng)估中等位基因頻率對(duì)體細(xì)胞突變的解讀尤為重要，特別是在缺乏配對(duì)正常樣本的時(shí)候。目前較為通行的注釋文件格式為VCF格式，可從中分析相關(guān)信息。常見軟件有：
表3 突變注釋軟件
| Software | Location (URL) |
| Annovar√ | http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/ |
| snpEff | http://snpeff.sourceforge.net/ |
| SeattleSeq | http://snp.gs.washington.edu/SeattleSeqAnnotation138/ |
| AnnTools | http://anntools.sourceforge.net/ |
| NGS-SNP | https://www.ualberta.ca/~stothard/downloads/NGS-SNP/ |
| VEP (Variant Effect Predictor) | http://useast.ensembl.org/info/docs/tools/vep/index.html |
表注：
表格為不有效統(tǒng)計(jì)，賊后更新日期2016年6月7日。
表4 突變解析軟件
| Variant caller | Location (URL) |
| MuTect v1.1.555 | https://www.broadinstitute.org/cancer/cga/mutect |
| GATK – MuTect v2 | https://www.broadinstitute.org/gatk/guide/tooldocs/org_broadinstitute_gatk_tools_walkers_cancer_m2_MuTect2.php |
| VarScan 256 | http://dkoboldt.github.io/varscan/ |
| VarDict57 | https://github.com/AstraZeneca-NGS/VarDict |
| Sterlka58 | https://sites.google.com/site/strelkasomaticvariantcaller/ |
| FreeBayes59 | https://github.com/ekg/freebayes |
| Scalpel60 | http://scalpel.sourceforge.net/ |
| Pindel61 | http://gmt.genome.wustl.edu/packages/pindel/ |
| SAMtools62 | http://samtools.sourceforge.net/ |
| Torrent Suite Variant Caller | https://github.com/iontorrent/TS |
| SomaticSniper63 | http://gmt.genome.wustl.edu/packages/somatic-sniper/ |
表注：
表格為不有效統(tǒng)計(jì)，賊后更新日期2016年6月7日。
6. 基于證據(jù)的體細(xì)胞變異分類的指導(dǎo)意見
基于循證醫(yī)學(xué)的體細(xì)胞變異分類的指導(dǎo)意見（Proposed Guideline for Evidence-Based Categorization of Somatic Variants），根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及工作組專家共識(shí)，提議將基因檢測(cè)相關(guān)臨床及實(shí)驗(yàn)證據(jù)分為4級(jí)：
表5 臨床及實(shí)驗(yàn)證據(jù)分類
| Category | Therapeutic | Diagnosis | Prognosis |
| Level A | Biomarkers that predict response or resistance to FDA-approved therapies for a specific type of tumor | Biomarkers included in professional guidelines as diagnostic for a specific type of tumor | Biomarkers included in professional guidelines as prognostic for a specific type of tumor |
| Biomarkers included in professional guidelines that predict response or resistance to therapies for a specific type of tumor | |||
| Level B | Biomarkers that predict response or resistance to therapies for a specific type of tumor based on well-powered studies with consensus from experts in the field | Biomarkers of diagnostic significance for a specific type of tumor based on well-powered studies with consensus from experts in the field | Biomarkers of prognostic significance for a specific type of tumor based on well-powered studies with consensus from experts in the field |
| Level C | Biomarkers that predict response or resistance to therapies approved by the FDA or professional societies for a different type of tumor | Biomarkers of diagnostic significance based on the results of multiple small studies | Biomarkers of prognostic significance based on the results of multiple small studies |
| Biomarkers that serve as inclusion criteria for clinical trials | |||
| Level D | Biomarkers of prognostic significance based on the results of multiple small studies | Biomarkers that may assist disease diagnosis themselves or along with other biomarkers based on small studies or a few case reports | Biomarkers that may assist disease prognosis themselves or along with other biomarkers based on small studies or a few case reports |
表注：
A級(jí)：可作為FDA批準(zhǔn)治療某種特異性腫瘤的生物標(biāo)志物（biomarker），或被收錄于某些特殊類型腫瘤的診斷、治療、預(yù)后評(píng)價(jià)的權(quán)威指南；
B級(jí)：可作為基于強(qiáng)力臨床試驗(yàn)證據(jù)和專家共識(shí)的治療某種特異性腫瘤的生物標(biāo)志物，或用于診斷、預(yù)后評(píng)估；
C級(jí)：可用于指導(dǎo)FDA批準(zhǔn)的標(biāo)注外用藥，或基于多個(gè)小規(guī)模研究的證據(jù)的診斷/預(yù)后評(píng)估；
D級(jí)：結(jié)果不確定的臨床前研究，可作為輔助標(biāo)志物，基于小規(guī)模研究且未達(dá)成共識(shí)。
圖2 基于證據(jù)體細(xì)胞變異分類（臨床影響力）
圖注：
I級(jí)：具有強(qiáng)臨床意義的變異（A級(jí)和B級(jí)證據(jù)）；
II級(jí)：具有潛在臨床意義的變異（C級(jí)或D級(jí)證據(jù)）；
III級(jí)：變異的臨床意義不確定；
IV級(jí)：與良性或疑似良性相關(guān)的變異。
7. 檢測(cè)結(jié)果報(bào)告與解讀
- 所有檢測(cè)到的變異都需要根據(jù)臨床影響力4級(jí)分級(jí)系統(tǒng)進(jìn)行分級(jí)標(biāo)識(shí)；
- 所有檢測(cè)到的變異都需要按照HUGO基因命名委員會(huì)規(guī)則注釋與報(bào)告，報(bào)告中也應(yīng)包含其他必要信息；
- 生殖系變異在報(bào)告中可不加以區(qū)分，若報(bào)告生殖系變異需符合當(dāng)?shù)胤膳c政策（患者需簽署知情同意書等）；
- 報(bào)告檢測(cè)到變異的臨床意義；
- 報(bào)告可隨相關(guān)醫(yī)學(xué)知識(shí)的更新而發(fā)生變化，當(dāng)有特殊需求時(shí)可考慮更新報(bào)告；
- 實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)隨檢測(cè)結(jié)果一同報(bào)告；
- 可將檢測(cè)報(bào)告與電子病歷系統(tǒng)整合。
注：
1. NGS分析無法區(qū)分體系變異與生殖系變異；
2. 生殖系變異的報(bào)告需要依據(jù)ACMG/AMP指南。
8. 結(jié)論
在癌癥基因組譜中越來越多地使用NGS技術(shù)，給臨床實(shí)驗(yàn)室?guī)砹诵碌奶魬?zhàn)。分子專業(yè)人員的關(guān)鍵任務(wù)之一是，基因測(cè)序檢測(cè)到的癌癥相關(guān)序列變體的解釋和報(bào)告的標(biāo)準(zhǔn)化。擬議的“癌癥序列變異解釋與報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)指南”代表了工作組成員的專家一致意見及他們代表的利益相關(guān)者的意見。該建議描述了一個(gè)基于證據(jù)的變量分類系統(tǒng)，以及變量注釋，分類和報(bào)告的過程。該報(bào)告還列出了常用于NGS數(shù)據(jù)分析的有用的生物信息學(xué)工具和數(shù)據(jù)庫。這些建議應(yīng)作為臨床實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員和腫瘤學(xué)家的教育資源，以輔助變體解釋和臨床決策。我們希望本文提供的指南將在癌癥基因組學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，并推動(dòng)癌癥患者的基因組檢測(cè)和正確治療實(shí)踐。
9. 免責(zé)聲明
分子病理學(xué)協(xié)會(huì)（AMP）臨床實(shí)踐指南和報(bào)告的開發(fā)，旨在為實(shí)踐和特定領(lǐng)域的實(shí)踐提供指導(dǎo)和建議，幫助實(shí)驗(yàn)室和其他衛(wèi)生保健專業(yè)人員。指南或報(bào)告不應(yīng)被視為包括所有正確的方式或方法，或排除其他方式或方法。指南或報(bào)告不能高效任何具體結(jié)果，也不能建立一種護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)。指南或報(bào)告不是要指定對(duì)特定患者的治療。治療決定必須基于健康護(hù)理提供者和每個(gè)患者的個(gè)體情況的獨(dú)立判斷。 AMP對(duì)本指南或報(bào)告不作任何明示或暗示的高效，特別不包括任何對(duì)特定用途或目的適銷性或適用性的高效。 AMP對(duì)與使用本文所含信息相關(guān)的直接，間接，特殊，偶然或繼發(fā)性損失概不負(fù)責(zé)。
10. 參考資料
http://jmd.amjpathol.org/article/S1525-1578(16)30223-9/fulltext#appsec1
(責(zé)任編輯：佳學(xué)基因)
