【佳學基因檢測】眼科基因檢測明確 3 型 Usher 綜合征家庭的突變位點

眼科基因檢測導讀：

Usher綜合征（USH）是一種嚴重的遺傳性疾病，主要表現(xiàn)為聽力和視力的雙重喪失。USH最早由蘇格蘭眼科醫(yī)生Charles Usher描述。據(jù)估計，先天性耳聾患者中USH的發(fā)病率約為3.5/100,000至16.6/100,000。該病是先天性重度或深度耳聾兒童的根本病因之一，占大約9.2%的病例。此外，USH僅次于Pendred綜合征，是最主要的綜合征性耳聾形式。

USH的主要臨床表現(xiàn)包括聽力喪失、視網(wǎng)膜色素變性、前庭功能障礙等。不同類型的USH在表現(xiàn)和發(fā)病時間上各有差異。USH為常染色體隱性遺傳。至今，眼科疾病的致病基因鑒定基因解碼鑒定并確認了9種致病基因，分別為：Usher 1型（USH1）的MYO7A、USH1C、CDH23、PCDH15和SANS；Usher 2型（USH2）的USH2A、ADGRV1和WHRN；Usher 3型（USH3）的CLRN1。

進行性聽力損失是USH3的顯著臨床特征。USH3患者通常在8-10歲時被診斷出聽力損失，但在20至30歲之間會出現(xiàn)快速進展的聽力喪失。視網(wǎng)膜色素變性（RP）通常在青春期后被診斷，平均診斷年齡為17歲，夜盲癥是最早出現(xiàn)的癥狀。與聽力損失的快速進展不同，USH3患者的視網(wǎng)膜色素變性的進展與USH1和USH2患者的進展沒有顯著差異。青春期后，視桿細胞退化，導致進行性視野喪失，最終發(fā)展為管狀視野和失明。此外，USH3A患者還表現(xiàn)出不同程度的前庭功能障礙，約51%的受檢患者在前庭測試中顯示異常。

早在1995年，Eeva-Marja Sankila等人將唯一負責USH3的基因定位于3q21-25位點。隨后，2002年，Avital Adato等人在人類和小鼠中鑒定了USH3A轉錄本。通過分析USH3A的表達模式，利用原位雜交技術在小鼠的耳蝸毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞中鑒定出該基因的轉錄本，并將其命名為clarin-1。經(jīng)過近十年的努力，人類CLRN1基因的位點最終被確定為3q25.1。通過基因解碼明確，與其他四跨膜蛋白類似，CLRN1僅保留有限的親水區(qū)，受胞質或胞外水相影響，明顯缺乏任何功能結構域，至少已有三種剪接異構體被報道（見圖1）。所有已知的CLRN1突變均位于異構體a的三個外顯子上，除了異構體e的外顯子0和外顯子0b之間的內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)的內(nèi)含子突變?；蚪獯a表明，CLRN1基因的主要異構體編碼一個232個氨基酸的蛋白質，預測該蛋白質具有四個跨膜結構域和一個位于第一個細胞外環(huán)中的糖基化位點。

CLRN1在小鼠耳蝸毛細胞毛束的形態(tài)形成和維持中起著重要作用，也可能具有突觸作用。體外生化分析表明，CLRN1可作為分子支架發(fā)揮作用，在不同質膜區(qū)域募集參與細胞粘附的蛋白質，并在組織肌動蛋白細胞骨架的組織中發(fā)揮作用。與該功能一致，Clrn1敲除（KO）小鼠和N48K敲除小鼠在幼年時表現(xiàn)出發(fā)育不良的毛束，并在出生后第21天（P21）嚴重失聰[。然而，與其他USH疾病小鼠模型類似，這些小鼠并不表現(xiàn)出USH3患者的眼部表型。盡管在臨床患者中存在遺傳和表型特征，但CLRN1的分子功能及其與其他Usher基因產(chǎn)物的關系和相互作用通過數(shù)據(jù)庫比對基因檢測難以明確。

佳學基因眼科疾病基因檢測病案集描述了一個遺傳性耳聾家系的分子病因學基因解碼。該家系共有2名患者，跨越3代。所有患者均出現(xiàn)雙側神經(jīng)性聽力損失（SHL）、進行性視力喪失和夜盲癥。通過詳細的臨床病史資料，結合完整的體格檢查、影像學檢查和分子病因學評估，評估永生化淋巴細胞系CLRN1基因的分子致病機制。本案例明確家系的特殊臨床表型和分子病因，為家系及后代提供實用有效的遺傳咨詢，并為USH3在中國人群的長期基因解碼提供更多資源。

(A)突變位點出現(xiàn)在 CLRN1 的不同轉錄本中。(B) CLRN1 的點突變可導致不同轉錄本中出現(xiàn)不同的氨基酸序列變化
 

臨床評估

臨床評估由耳鼻喉科醫(yī)師、眼科醫(yī)生和臨床遺傳學家完成，包括耳鏡檢查、視覺強化、聽力檢查、鼓室測量、聲反射、純音聽力檢查或播放聽力檢查、失真產(chǎn)物誘發(fā)耳聲發(fā)射 (DPOAE)、聽覺腦干反應 (ABR) 和聽覺穩(wěn)態(tài)反應 (ASSR)。在 0.25–8.0 kHz 的倍頻程下確定雙側氣導 (AC) 閾值。測量 0.5、1、2 和 4 kHz 對話頻率下的 AC 平均閾值，并用于定義聽力損失嚴重程度。聽力水平被標記為輕微 (16–25 dB)、輕度 (26–40 dB)、中度 (41–70 dB)、重度 (71–95 dB) 或極重度 (95 dB)。對部分家屬進行最佳矯正視力、雙眼視覺誘發(fā)電位（VEP）、視野及眼底檢查，并進行高分辨率計算機斷層掃描（HRCT）檢查，以核實家屬是否患有聽力障礙以外的并發(fā)癥。

外周血樣本

在獲得知情同意后，從所有家系成員、500 名正常對照個體（263 名男性和 237 名女性，年齡 18 至 25 歲）和 122 個無關中國家系采集血液樣本（2 ml + 5 ml）。

靶向基因捕獲和高通量測序

采用苯酚/氯仿法從受試者的外周血白細胞中獲取基因組DNA。使用Nanodrop 2000分光光度計對DNA進行定量。采用下一代測序（NGS）技術鑒定該家系的致病基因。在靶向捕獲和大規(guī)模并行測序（MPS）過程中，使用Covaris S2聚焦超聲（Covaris，馬薩諸塞州，美國）隨機切割符合一定標準的先證者（II-4）的合格gDNA，平均片段大小為350–400 bp。然后修復片段尖端，連接到適配器，并使用Agilent 2100生物分析儀進行分析。使用GenCap試劑盒（MyGenostics，北京，中國）捕獲所有外顯子和側翼內(nèi)含子區(qū)域，6個與耳聾相關的線粒體區(qū)域和139個與耳聾相關的核基因的3個miRNA（補充 表1、2和3 ）。使用 NextSeq 500 下一代測序儀（美國加利福尼亞州圣地亞哥 Illumina Inc.）對捕獲的序列進行高通量測序。

臨床表型分析

患者來自某三代遺傳性耳聾家系（見圖2A），該家系為常染色體隱性遺傳。先證者為Ⅱ-4，女性，47歲，其父母Ⅰ-1和Ⅰ-2為近親結婚。患者雙耳聽力嚴重減退（圖2C），雙眼視力低下。大約在10歲時，患者開始出現(xiàn)雙耳聽力逐漸喪失的情況；13歲時，視力障礙逐步加重，并伴有夜盲癥。過去10年內(nèi)，雙眼視力明顯下降。

眼科檢查（如圖2E所示）顯示，左眼的最佳矯正視力（BCVA）為0.4，右眼為0.7。雙眼的視覺誘發(fā)電位（VEP）檢查結果顯示，雙眼P100波峰的潛伏期延遲，且幅度減小。雙眼視野檢查結果提示出現(xiàn)管狀視野。雙眼彩色眼底檢查結果表明，視盤邊界清晰，呈蠟黃色；黃斑區(qū)反光不清；視網(wǎng)膜血管變窄；視網(wǎng)膜呈灰白色，赤道部視網(wǎng)膜可見色素沉著，這些都是晚期視網(wǎng)膜色素變性（RP）的典型表現(xiàn)。

家譜圖（A）、突變信息（B）、聽力圖（C）、顳葉CT掃描（D）和眼科信息（E）

（A）家族家譜圖：填充的黑色符號（男性為方形，女性為圓形）表示患病個體（II-1、II-4），空心符號代表未患病個體。箭頭指向患兒。

（B）DNA序列色譜圖：顯示II-1和II-4的CLRN1基因突變，分別為c.474T > A（P.Cys158Ter，NM_001256819.2）和c.302T > A（p.Val101Asp，NM_174878.3）這兩種新型純合變異。

（C）聽力圖：患病兄弟姐妹的聽力圖顯示雙側嚴重神經(jīng)性耳聾。橫軸表示音頻頻率（Hz），縱軸表示聽力閾值（dB）。

（D）顳葉CT掃描：顳葉CT掃描結果未見明顯的異常。

（E）眼科檢查：雙眼VEP檢查顯示患兒雙眼P100波峰潛伏期延遲且波幅減小。雙眼視野檢查結果提示雙眼出現(xiàn)管狀視野。雙眼彩色眼底檢查顯示，雙眼視神經(jīng)乳頭邊界清晰，呈蠟黃色；黃斑區(qū)反光不清；視網(wǎng)膜血管變窄，視網(wǎng)膜呈灰白色，赤道部視網(wǎng)膜出現(xiàn)色素沉著，這些表現(xiàn)均為晚期視網(wǎng)膜色素變性（RP）的典型特征。

II-1為先天性耳聾患者，出生后聽力反應不佳，自幼視力不佳，但未做過眼科檢查，已喪失視力及生活自理能力。

靶向高通量測序及共分離驗證結果

佳學基因對先證者 (II-4) 的 139 個耳聾基因的所有編碼外顯子加上約 100 bp 的側翼內(nèi)含子序列進行了測序。目標區(qū)域的平均覆蓋深度在 110–160 倍之間，其中 > 98% 的覆蓋深度 > 20 倍。因此，佳學基因從面板分析中獲得的結果不僅在很大程度上排除了 Usher 綜合征基因和導致類似綜合征的基因編碼序列中的突變，例如 ABHD12 突變和HARS突變，而且還排除了與耳聾和 RP 相關的基因同時發(fā)生的突變，導致模仿 Usher 綜合征的表型。最后，在轉錄本NM_001256819.2處檢測到一種新的純合變體，其中致病性并不總是被報告，CLRN1:c.474T > A (P.Cys158Ter)，在患者 II-4 和 II-1 中均被檢測到。如果變體為 c.302T > A，則基于 MANE 選擇轉錄本NM_174878.3，該轉錄本為 p.Val101Asp。

p.Cys158Ter 突變影響 Clarin-1 功能

CLRN1 c.302T > A ( NM_174878.3 )突變導致101位纈氨酸殘基變?yōu)樘於彼?，如圖 5所示，Alphafold2預測軟件顯示CLRN1 c.302T > A導致alpha折疊異常，并未引起其他空間結構變化。而CLRN1 c.474T > A ( NM_001256819.2 )突變發(fā)生在第158位氨基酸，對應cDNA產(chǎn)生終止密碼子，導致翻譯提前終止。大片段氨基酸的丟失最終影響蛋白質的空間結構（圖 6 ） 。CLRN1 c.474T > A ( NM_001256819.2 )致病性的預測結果見（表 6、7）。

Alphafold2 預測軟件顯示 CLRN1c.302T > A 導致 alpha 折疊異常，并未引起其他空間結構變化


CLRN1 c.474T > A( NM_001256819.2 )突變發(fā)生在第158個氨基酸處，相應cDNA產(chǎn)生終止密碼子，導致翻譯提前終止。

基因檢測解讀

本案例對一個跨三代遺傳性耳聾家系中的2名患者進行了臨床表型和分子病因學分析。根據(jù)先證者和家系中部分患者表現(xiàn)出的進行性聽力喪失與視力喪失，并結合先證者的眼科檢查，初步診斷為USH3。經(jīng)分子檢測，發(fā)現(xiàn)這2名患者均攜帶CLRN1基因的純合突變：c.474T > A（P.Cys158Ter，NM_001256819.2）或c.302T > A（p.Val101Asp，NM_174878.3）。隨后，采用Sanger測序驗證了這些變異位點，并證實了CLRN1 c.474T>A（P.Cys158Ter，NM_001256819.2）或c.302T>A（p.Val101Asp，NM_174878.3）突變與該家系的基因型-表型共分離。

USH3的臨床表現(xiàn)主要為語言后進行性雙側對稱性神經(jīng)性耳聾（SHL），伴隨前庭功能減退，通常會出現(xiàn)視網(wǎng)膜色素變性（RP），且發(fā)病年齡一般在20歲之前[7]。盡管如此，USH3的臨床表型具有顯著的遺傳異質性和表型特異性。目前已知，CLRN1基因突變是USH3A的主要致病原因，而HARS基因突變則與USH3B相關[15]。與USH1和USH2相比，USH3較為罕見，盡管Hope等[16]曾報道USH3占伯明翰地區(qū)USH患者的約20%，而Ness等[5]則指出，該亞型在芬蘭和阿什肯納茲猶太人群體中約占40%。然而，在西班牙人群的基因解碼中，對89名無USH3病史的USH患者進行分析時，只有8例為USH3患者，發(fā)病率僅為6%[8]。在中國人群中，尚未有關于家族性USH3的報道，現(xiàn)有病例多為散發(fā)的眼部疾病相關病例。

由于USH3患者的表型異質性不僅在不同家系之間存在顯著差異，甚至在同一家系內(nèi)也表現(xiàn)出較大的異質性，Ness等[5]認為，合并SHL的USH3患者在表型上較為一致，可作為區(qū)別USH3與USH2、USH1的重要標志。另一個常用的區(qū)分標準是耳聾的發(fā)病時間，語后SHL是USH3的典型特征，而語前耳聾則更常見于USH1和USH2患者。

在本案例中，先證者展現(xiàn)了典型的USH3臨床癥狀，尤其是在聽力、視力以及典型的RP方面，其發(fā)病年齡和進展與文獻報道一致。然而，她的哥哥（II-1）則表現(xiàn)出不同的臨床表型：從出生開始雙耳即為重度SHL，夜盲癥早期出現(xiàn)，且雙眼視功能較差，幾乎完全喪失。因此，家族內(nèi)USH3患者的臨床表現(xiàn)存在一定差異。Adato等[17]曾報道，在一例也門猶太裔非近親家族中，出現(xiàn)了兩種不同的臨床表型：一例為USH1，另一例為USH3，表明在同一家系內(nèi)，USH的臨床表型可能因不同突變類型而有所不同。類似地，Ness等[5]也在德系猶太人群中發(fā)現(xiàn)，雖然所有USH患者均攜帶CLRN1基因突變，但攜帶p.N48K純合突變的患者表現(xiàn)出更為嚴重的臨床表型，尤其在聽力損失的早期和快速進展上有明顯特點。

盡管USH3的聽力損失進展較為緩慢，但一些病例與USH2A、USH1B及USH1D的變異表現(xiàn)相似。隨著病例數(shù)據(jù)的積累，USH3的臨床表型已逐漸呈現(xiàn)更多樣化，基因診斷的準確性和可靠性也得到提高?；诒景咐推渌墨I的分析，進行性SHL和語后耳聾并不一定能作為診斷USH3的決定性標準。

本案例的重要意義體現(xiàn)在以下幾個方面：首先，NCBI網(wǎng)站記錄了CLRN1基因的四個轉錄本（圖1），由于這些轉錄本包含的外顯子不同，因此它們編碼的氨基酸序列也有所差異，這有助于解釋為何CLRN1突變會導致臨床表型的多樣性。NM_174878.3和NP_777367（isoform a由轉錄變體1編碼）包含外顯子0-1-2，編碼一個約25.8kDa、含232個氨基酸的clarin-1蛋白[18]。已知的CLRN1突變，除了位于isoform e的外顯子0和外顯子0b之間的內(nèi)含子區(qū)域外，其他都位于isoform a的外顯子3上。除芬蘭人群中的p.Y176X和p.P120K突變[19]，以及阿什肯納茲猶太人群中的p.N48K突變[20]外，其他多數(shù)突變均在單個家族中發(fā)現(xiàn)。除這些常見突變外，迄今已報道了21種錯義突變、無義突變、2種異常剪接突變、7種缺失突變和3種插入突變（截至2023年3月的人類基因突變數(shù)據(jù)庫）。

2017年，Khan等[21]報道了一個CLRN1內(nèi)含子突變c.254–649T > G（NM_001256819.1，異構體e），該突變發(fā)生在阿拉伯半島的一個近交系USH1患者中，位于外顯子0和外顯子0b之間的內(nèi)含子區(qū)域。實驗顯示，該突變導致外顯子剪接異常，進而導致移碼和提前終止密碼子的產(chǎn)生。這一突變也被認為是一個創(chuàng)始等位基因，對阿拉伯半島的聾盲患者有顯著影響。

通過使用Alphafold2預測軟件，我們發(fā)現(xiàn)家族性患者攜帶的CLRN1突變[CLRN1 c.474T > A(P.Cys158Ter, NM_001256819.2)或c.302T > A(p.Val101Asp, NM_174878.3)]對不同轉錄本的影響各異。雖然我們未能從患者來源的ILCL中獲得直接證據(jù)，但在HEK293T細胞中，我們確認了特定轉錄本的表達，并通過質粒表達實驗觀察到c.474T > A(P.Cys158Ter, NM_001256819.2)引起的蛋白表達差異。這一機制可能是由于突變導致的可變剪接，從而引起蛋白質降解。

CLRN1 c.474T > A（P.Cys158Ter）變異尚未見報道，至今未在任何公共數(shù)據(jù)庫（如單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫、人類基因突變數(shù)據(jù)庫等）中出現(xiàn)過。根據(jù)ACMG/AMP致病性分析指南，這一變異通過體外實驗驗證，已被證明會導致蛋白表達異常并損害基因功能（PS3），且在正常人群中未見該變異（PM2）。結合臨床表現(xiàn)和家族基因型-表型共分離的證據(jù)（PP4和PP1），我們最終判斷CLRN1 c.474T > A（P.Cys158Ter）為致病突變，并認為這是中國人群中首次報道的USH3突變。

基因檢測結論

本案例確定CLRN1 c.474T > A純合變異（P.Cys158Ter，NM_001256819.2）在中國家系中引發(fā)USH3。該突變與芬蘭和阿什肯納茲猶太人群中的常見版本不同，因此其發(fā)現(xiàn)為USH3A的發(fā)病機制和預防基因解碼提供了新的視角，也提示我們在基因解碼不同轉錄本時應特別關注其可能的臨床影響。