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【佳學(xué)基因檢測(cè)】人體細(xì)胞年輕態(tài)的基因檢測(cè)與評(píng)價(jià)方法

【佳學(xué)基因檢測(cè)】人體細(xì)胞年輕態(tài)的基因檢測(cè)與評(píng)價(jià)方法 端?;驒z測(cè)導(dǎo)讀: 端粒縮短是生物衰老的一個(gè)眾所周知的生物標(biāo)志物。佳學(xué)基因?qū)y(cè)量端粒長(zhǎng)度的方法進(jìn)行的一項(xiàng)比較研究發(fā)現(xiàn),使

佳學(xué)基因檢測(cè)】人體細(xì)胞年輕態(tài)的基因檢測(cè)與評(píng)價(jià)方法

端粒基因檢測(cè)導(dǎo)讀:

端粒縮短是生物衰老的一個(gè)眾所周知的生物標(biāo)志物。佳學(xué)基因?qū)y(cè)量端粒長(zhǎng)度的方法進(jìn)行的一項(xiàng)比較研究發(fā)現(xiàn),使用不同的方法技術(shù)進(jìn)行研究結(jié)果的比較是困難的。賊常用的高通量測(cè)量平均端粒長(zhǎng)度的方法是定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)方法,有兩種可用的方案:相對(duì)端粒長(zhǎng)度(relative 端粒長(zhǎng)度)和先進(jìn)端粒長(zhǎng)度(先進(jìn)端粒長(zhǎng)度)方法。所有的qPCR方法都有相似之處,它們使用兩組不同的引物來(lái)測(cè)量端粒重復(fù)序列(TTAGGG)n和單拷貝基因區(qū)域,以計(jì)算平均端粒長(zhǎng)度(T/S比率)。相對(duì)端粒長(zhǎng)度和先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定的差異在于引入了雙鏈寡聚體標(biāo)準(zhǔn)來(lái)識(shí)別端粒長(zhǎng)度,而不是使用傳統(tǒng)的相對(duì)端粒長(zhǎng)度(T/S比率)方法。先前的研究注意到36B4(RPLP0)作為適合的單拷貝基因qPCR測(cè)定的問(wèn)題。一項(xiàng)先前的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度出版物嘗試使用干擾素β 1基因(IFNB1)替代36B4(RPLP0)單拷貝基因,但與DNAm端粒長(zhǎng)度測(cè)定結(jié)果相比,結(jié)果顯示與端粒長(zhǎng)度結(jié)果的一致性不足。在這里,我們比較了先前用于先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定的兩種單拷貝基因測(cè)定方法,并提供了一種無(wú)非特異性引物擴(kuò)增的替代IFNB1單拷貝基因測(cè)定方法,以提供更一致的二倍體拷貝數(shù)確定和更高效、重復(fù)性強(qiáng)的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定方法。

端粒長(zhǎng)度基因檢測(cè)

端粒縮短是佳學(xué)基因發(fā)現(xiàn)并推出的一個(gè)較為正確的人體及細(xì)胞衰老的生物標(biāo)志物。端粒長(zhǎng)度(端粒長(zhǎng)度)已經(jīng)被廣泛用于揭示細(xì)胞的衰老過(guò)程現(xiàn)象,以及與人類健康和疾病(如癌癥、心血管疾病、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病等)相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素。測(cè)量端粒長(zhǎng)度可以使用多種方法進(jìn)行。其中一種方法是相對(duì)端粒長(zhǎng)度t方法的qPCR方法。佳學(xué)基因端粒長(zhǎng)度檢測(cè)的qPCR方法采用的是獲得諾貝爾獎(jiǎng)的酶學(xué)原理,在這一種方法中,采用基因解碼技術(shù)獲得的端粒序列指導(dǎo)設(shè)計(jì)項(xiàng)目檢測(cè)專用引物,通過(guò)擴(kuò)增端粒區(qū)域以確定端粒重復(fù)序列,并使用另一組引物擴(kuò)增單拷貝基因區(qū)域以確定在測(cè)試樣本中被測(cè)量的基因組拷貝數(shù)。先進(jìn)端粒長(zhǎng)度(先進(jìn)端粒長(zhǎng)度)方法與相對(duì)端粒長(zhǎng)度方法不同之處在于引入了兩個(gè)獨(dú)立的qPCR測(cè)定,使用雙鏈寡聚體構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別確定端粒重復(fù)序列或基因組拷貝數(shù)。通過(guò)引入序列稀釋的84mer雙鏈寡聚體標(biāo)準(zhǔn),其中TTAGG重復(fù)14次,可以構(gòu)建端粒標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而確定端粒重復(fù)序列的平均數(shù),單位為千堿基對(duì)(kbp)。通過(guò)引入另一個(gè)獨(dú)立的qPCR測(cè)定,使用單拷貝參考基因的雙鏈寡聚體標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以測(cè)量每個(gè)二倍體基因組的總端粒長(zhǎng)度(以千堿基/染色體計(jì))。

相對(duì)端粒長(zhǎng)度和先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定所使用的方法常用的方法是使用36B4基因作為單拷貝基因。賊初認(rèn)為36B4(RPLP0)基因測(cè)定是一個(gè)合適的單拷貝基因候選者,因?yàn)樵摲椒ㄔO(shè)計(jì)良好,遵循PCR技術(shù)標(biāo)準(zhǔn),引物長(zhǎng)度為18-24個(gè)堿基對(duì),擴(kuò)增目標(biāo)序列長(zhǎng)度在75-150個(gè)堿基對(duì)之間,G/C含量為40-60%,引物的起始或末端具有一到兩個(gè)G/C堿基對(duì)以增強(qiáng)引物的穩(wěn)定性。36B4(RPLP0)單拷貝基因位于染色體12q24.23區(qū)域(https://omim.org/entry/180510),該基因測(cè)定也設(shè)計(jì)得很好,引物序列中沒(méi)有互補(bǔ)或重復(fù)區(qū)域。佳學(xué)基因發(fā)現(xiàn)這一方法存在未被認(rèn)知的缺陷。佳學(xué)基因根據(jù)人類基因信息的精細(xì)解碼,發(fā)現(xiàn)在人類基因組中,36B4基因是具有多個(gè)偽基因的典型核糖體基因,而兩個(gè)引物均與染色體2和12上的基因組序列互補(bǔ)。此外,正向引物與染色體1、18以及反向引物與染色體5高度同源。

佳學(xué)基因新研究的方法使用了一種可行的用于相對(duì)端粒長(zhǎng)度測(cè)量的單拷貝基因替代方法,使用干擾素β 1基因(IFNB1)。這個(gè)位于染色體9p21.3區(qū)域的IFNB1基因編碼一種屬于干擾素家族的信號(hào)蛋白細(xì)胞因子,與COVID-19對(duì)先天免疫系統(tǒng)的自然衰老和端粒消耗有關(guān)。在新改進(jìn)的端粒長(zhǎng)度相對(duì)測(cè)定方法中,IFNB1引物是一個(gè)更好的單拷貝基因,因?yàn)樗鼈冎唤Y(jié)合到染色體9p21.3的一個(gè)位置,沒(méi)有已知的變異位點(diǎn)。端粒相對(duì)長(zhǎng)度的使用研究進(jìn)一步確認(rèn)了該方法的可行性與高效性,些相對(duì)端粒長(zhǎng)度研究已經(jīng)將這個(gè)IFNB1 端粒長(zhǎng)度測(cè)定方法納入到Telomeric DNA:RNA免疫沉淀(Telo-DRIP)qPCR方法并產(chǎn)生了好的結(jié)果,這些結(jié)查揭示出在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中端粒酶活性對(duì)端粒長(zhǎng)度的影響,以及顯示TERF1自身抗體與嚴(yán)重肺疾病中淋巴細(xì)胞端粒長(zhǎng)度短相關(guān)。

佳學(xué)基因?qū)Χ肆iL(zhǎng)度測(cè)量方法也進(jìn)一步優(yōu)化了端粒先進(jìn)長(zhǎng)度(先進(jìn)端粒長(zhǎng)度)的qPCR方法,在這一更新的方法中使用了IFNB1作為單拷貝基因。該方法使用一個(gè)83mer的IFNB1雙鏈寡聚體生成了單拷貝基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用IFNB1作為單拷貝基因的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法的比較研究未能得到與以DNA甲基化為基礎(chǔ)的端粒長(zhǎng)度估算器(DNAm端粒長(zhǎng)度)方法生成的端粒長(zhǎng)度結(jié)果一致。為了找出這種差異的可能原因,佳學(xué)基因解碼進(jìn)行了生物信息學(xué)和遺傳分析,以確定作為單拷貝基因的IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定的性能如何。佳學(xué)基因端?;驒z測(cè)將這些結(jié)果與使用36B4(RPLP0)作為單拷貝基因獲得的結(jié)果進(jìn)行比較,后者已被確定為不適合測(cè)量端粒長(zhǎng)度的單拷貝基因。通過(guò)基因解碼基因檢測(cè)技術(shù),佳學(xué)基因發(fā)現(xiàn)了其他基因檢測(cè)方法中導(dǎo)致端粒長(zhǎng)度結(jié)果相關(guān)性缺失的可能原因,并提供了一種替代的基于IFNB1的單拷貝基因qPCR測(cè)定方法,用于使用先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法測(cè)量端粒長(zhǎng)度。

表1. 36B4(RPLP0)、比較IFNB1單拷貝基因和替代IFNB1單拷貝基因qPCR測(cè)定中使用的端粒重復(fù)序列和單拷貝基因的PCR引物和寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)。

引物/寡聚體 序列
Telomere-F 5′- CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT -3′
Telomere-R 5′- GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT -3′
Telomere oligomer (sense) 5′-CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA -3′
Telomere oligomer (anti-sense) 5′- TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG-3′
Comparative IFNB1-F 5′-TGG CAC AAC AGG TAG TAG GCG ACA C- 3′
Comparative IFNB1-R 5′-GCA CAA CAG GAG AGC AAT TTG GAG GA- 3′
Comparative IFNB1 oligomer (sense) 5′-GCA CAA CAG GAG AGC AAT TTG GAG GAG ACA CTT GTT GGT CAT GTT GAC AAC ACG AAC AGT GTC GCC TAC TAC CTG TTG TGC CA- 3′
Comparative IFNB1 oligomer (anti-sense) 5′-TGG CAC AAC AGG TAG TAG GCG ACA CTG TTC GTG TTG TCA ACA TGA CCA ACA AGT GTC TCC TCC AAA TTG CTC TCC TGT TGT GC- 3′
Alternative IFNB1-F 5′- GGA CTG GAC AAT TGC TTC AAG -3′
Alternative IFNB1-R 5′- CCT TTC ATA TGC AGT ACA TTA G -3′
Alternative IFNB1 oligomer (sense) 5′-CCT TTC ATA TGC AGT ACA TTA GCC ATC AGT CAC TTA AAC AGC ATC TGC TGG TTG AAG AAT GCT TGA AGC AAT TGT CCA GTC C- 3′
Alternative IFNB1 oligomer (anti-sense) 5′-GGA CTG GAC AAT TGC TTC AAG CAT TCT TCA ACC AGC AGA TGC TGT TTA AGT GAC TGA TGG CTA ATG TAC TGC ATA TGA AAG G- 3′
36B4-F 5′-CAG CAA GTG GGA AGG TGT AAT CC- 3′
36B4-R 5′-CCC ATT CTA TCA TCA ACG GGT ACA A- 3′
36B4 oligomer (sense) 5′-CAG CAA GTG GGA AGG TGT AAT CCG TCT CCA CAG ACA AGG CCA GGA CTC GTT TGT ACC CGT TGA TGA TAG AAT GGG- 3′
36B4 oligomer (anti-sense) 5′-CCC ATT CTA TCA TCA ACG GGT ACA AAC GAG TCC TGG CCT TGT CTG TGG AGA CGG ATT ACA CCT TCC CAC TTG CTG- 3′

Key: Forward primer = F; Reverse primer = R.

佳學(xué)基因檢測(cè)如何評(píng)估端粒長(zhǎng)度基因檢測(cè)的正確性?

佳學(xué)基因端粒長(zhǎng)度基因檢測(cè)正確性研究采用4名男性參與者(年齡范圍:8至50歲)和4名女性參與者(年齡范圍:15至52歲)。從同一成年參與者采集了全血和唾液,而從8歲和15歲的參與者只采集了唾液。另外還從一名額外的男性和女性參與者采集了全血和唾液,并與其他參與者一起進(jìn)行測(cè)試,以展示作為先進(jìn)端粒長(zhǎng)度分析的單拷貝基因的IFNB1替代方法的重復(fù)性。采集了全血,并按照制造商的方案使用Qiagen mini試劑盒進(jìn)行提取。使用Genotek Oragene試劑盒采集唾液,并按照制造商建議的方法進(jìn)行提取。使用ThermoFisher Scientific Quant-it dsDNA Assay試劑盒(目錄號(hào):P11496)按照制造商的方案確定雙鏈DNA濃度。從全血和唾液提取的DNA樣本使用先前發(fā)表的36B4(RPLP0)和比較性IFNB1單拷貝基因測(cè)定方法的端粒重復(fù)序列和單拷貝基因qPCR協(xié)議進(jìn)行測(cè)試,使用的引物和寡聚體列在《佳學(xué)基因基因檢測(cè)序列使用數(shù)據(jù)庫(kù)》。使用引物和寡聚體的qPCR檢測(cè)方案。還重復(fù)測(cè)試了相同的DNA樣本兩次,并額外測(cè)試了4個(gè)使用IFNB1單拷貝基因測(cè)定方法的樣本。研究使用的所有引物和寡聚體均使用IDT(Integrated DNA technology)合成。所有引物均為HPLC純化,而寡聚體為PAGE純化。

表2. 比較IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定、替代IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定和36B4(RPLP0)先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定的qPCR運(yùn)行條件

  Comparative Telomere and IFNB1 qPCR no plasmid Telomere qPCR with plasmid Comparative IFNB1 qPCR with plasmid Alternative IFNB1 qPCR with plasmid 36B4 (RPLP0) qPCR with plasmid
qPCR running conditions 50 °C: 2 mins;
95 °C: 15 mins;
45 cycles
(95 °C:15 secs; 60 °C: 1 min;
72 °C: 30 secs)
50 °C: 2 mins;
95 °C:15 mins;
40 cycles
(95 °C:15 secs; 60 °C: 1 min)
50 °C: 2 mins;
95 °C:15 mins;
40 cycles
(95 °C:15 secs; 60 °C: 1 min)
50 °C: 2 mins;
95 °C:15 mins;
40 cycles
(95 °C:15 secs; 60 °C: 1 min)
50 °C: 2mins;
95 °C: 15 mins;
40 cycles
(95 °C:15 secs; 60 °C: 1 min)

 

Key: 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度 = absolute telomere length; IFNB1 = interferon beta 1; mins = minutes; secs = seconds.

使用先前發(fā)表的比較性IFNB1和36B4(RPLP0)單拷貝基因測(cè)定進(jìn)行端粒測(cè)量

表1顯示了用于端粒重復(fù)序列、比較性IFNB1和36B4(RPLP0)單拷貝基因qPCR測(cè)定的引物和寡聚體模板對(duì)照。佳學(xué)基因比較不同端粒的qPCR測(cè)定中用于確定端粒重復(fù)序列和每個(gè)單拷貝基因的qPCR檢測(cè)方案列在表2中。由于先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法在單個(gè)qPCR擴(kuò)增方法中使用SYBR Green(而不是多重?cái)U(kuò)增),因此幾乎沒(méi)有信號(hào)泄漏導(dǎo)致端粒qPCR測(cè)定的端粒重復(fù)序列數(shù)量或單拷貝基因qPCR測(cè)定的二倍體拷貝數(shù)出現(xiàn)問(wèn)題的擔(dān)憂。

端粒重復(fù)序列標(biāo)準(zhǔn)曲線使用60 pg(6 × 10-11 g)的端粒雙鏈寡聚體濃度進(jìn)行十倍稀釋。比較性IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線使用2 pg(2 × 10-12 g)的比較性IFNB1雙鏈寡聚體濃度進(jìn)行十倍稀釋,生成的稀釋液范圍從標(biāo)準(zhǔn)1的0.2 pg到標(biāo)準(zhǔn)5的0.00002 pg(使用4 uL寡聚體)。由于在比較性IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定中發(fā)現(xiàn)潛在問(wèn)題,佳學(xué)基因還通過(guò)向每個(gè)比較性IFNB1寡聚體濃度中添加質(zhì)粒DNA(pBR322)并執(zhí)行兩步qPCR方案來(lái)測(cè)試該測(cè)定,如表2所列。

佳學(xué)基因還使用使用200 pg(200 × 10-12 g)的36B4(RPLP0)雙鏈寡聚體濃度進(jìn)行十倍稀釋,生成的稀釋液范圍從標(biāo)準(zhǔn)1的200 pg到標(biāo)準(zhǔn)5的0.2 pg。為了保持每個(gè)反應(yīng)管中的總DNA量為3 ng,我們向每個(gè)36B4(RPLP0)寡聚體稀釋液中添加了質(zhì)粒DNA(pBR322)(表2)。

使用替代IFNB1單拷貝基因qPCR測(cè)定的端粒長(zhǎng)度

為了評(píng)估采用IFNB1單基因?qū)Χ肆6葴y(cè)定結(jié)果的影響,佳學(xué)基因生成了替代IFNB1單拷貝基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,使用表1中列出的引物和寡聚體中的82mer雙鏈寡聚體。替代IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線是在表2中列出的qPCR檢測(cè)得到的。使用2 pg(2 × 10-12 g)的替代IFNB1寡聚體濃度進(jìn)行十倍稀釋,生成的稀釋液范圍從標(biāo)準(zhǔn)1的0.2 pg到標(biāo)準(zhǔn)5的0.00002 pg。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中,向每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)寡聚體稀釋液中添加環(huán)形質(zhì)粒DNA(pBR322,Thermo Fisher Scientific),以保持每個(gè)反應(yīng)管中的總DNA量為3 ng(表2)。替代IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線是使用包含1倍QuantiTect SYBR Green Master Mix(Qiagen)、0.01U尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG:Thermo Fisher Scientific)、0.1μM正向引物、0.1μM反向引物的混合溶液在20μL反應(yīng)中生成的。生成的IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算測(cè)試樣本中的二倍體基因組數(shù)量,該過(guò)程與用于端粒重復(fù)序列標(biāo)準(zhǔn)曲線qPCR混合液和qPCR條件的類似方案進(jìn)行了確定。

PCR擴(kuò)增是使用QIAgility機(jī)器人工作站(Qiagen,德國(guó))進(jìn)行的。實(shí)時(shí)定量PCR在50°C保持2分鐘激活UNG,然后在95°C保持15分鐘激活Qiagen Hotstar Taq DNA聚合酶,然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán),其中每個(gè)循環(huán)在95°C保持15秒,60°C保持1分鐘(表2),數(shù)據(jù)采集使用Rotor-Gene Q 5plex HRM(Qiagen,德國(guó))進(jìn)行。在qPCR擴(kuò)增完成后,通過(guò)從50°C到99°C每次升高1°C的方式產(chǎn)生解離曲線。Rotor-Gene Q qPCR儀器還會(huì)自動(dòng)確定每個(gè)板的端粒和IFNB1寡聚體標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct閾值。每個(gè)3 ng的DNA或寡聚體樣品都進(jìn)行了三次重復(fù)測(cè)量,并取平均值。為了減輕批次效應(yīng),在每次運(yùn)行中包含至少10次來(lái)自參考對(duì)照的重復(fù)測(cè)量。從短端粒陽(yáng)性對(duì)照(Jurkat細(xì)胞系;訪問(wèn)編號(hào)SD1111,Thermo Fisher Scientific)中提取的參考DNA進(jìn)行分裝并冷凍保存。對(duì)于每個(gè)樣品,通過(guò)將樣品中的二倍體基因組數(shù)除以從端粒標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的端粒重復(fù)數(shù)來(lái)計(jì)算每個(gè)樣品的總端粒長(zhǎng)度。由于每個(gè)二倍體基因組末端有兩個(gè)端粒,因此該端粒長(zhǎng)度數(shù)值然后除以92,以確定樣品中一個(gè)端粒的平均長(zhǎng)度。

端粒長(zhǎng)度測(cè)量結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用R Studio進(jìn)行分析。佳學(xué)基因使用了組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(ICC)統(tǒng)計(jì)量來(lái)分析作為測(cè)量平均端粒長(zhǎng)度的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法的可行替代性qPCR測(cè)定的替代IFNB1單拷貝基因的重復(fù)性。ICC是根據(jù)研究中使用的重復(fù)樣本批次中全血白細(xì)胞和唾液測(cè)定的端粒長(zhǎng)度計(jì)算得出的。

不同端粒長(zhǎng)度測(cè)量方法的比較結(jié)果

通過(guò)進(jìn)行生物信息學(xué)和遺傳分析,發(fā)現(xiàn)了比較性IFNB1單拷貝基因測(cè)定需要進(jìn)一步改進(jìn)的問(wèn)題。由于在修改IFNB1 的qPCR測(cè)定時(shí)這些問(wèn)題尚未解決,佳學(xué)基因?qū)⒃摐y(cè)定與另一種替代性IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定進(jìn)行了比較,并將所有IFNB1單拷貝基因qPCR測(cè)定的生物信息學(xué)和遺傳分析與36B4(RPLP0)單拷貝基因qPCR測(cè)定進(jìn)行了比較。

比較性IFNB1單拷貝基因先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定
 

生物信息學(xué)分析

在比較性IFNB1單拷貝基因先進(jìn)端粒長(zhǎng)度研究針對(duì)的是IFNB1基因區(qū)域的3'端。表1中列出的比較性IFNB1標(biāo)準(zhǔn)寡聚體序列顯示,使用83堿基對(duì)的雙鏈寡聚體模板與引物結(jié)合,生成已知二倍體拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。這個(gè)雙鏈寡聚體的長(zhǎng)度略長(zhǎng)于36B4(RPLP0)先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定中使用的75堿基對(duì)的雙鏈寡聚體,但仍處于建議的75-150 bp擴(kuò)增靶序列范圍內(nèi),以獲得賊佳PCR實(shí)驗(yàn)效果。

比較性IFNB1雙鏈寡聚體序列(表1中列出)在USCS基因組Blast搜索中顯示,這個(gè)83堿基對(duì)的模板僅位于IFNB1基因的9p21.3染色體位置,并且與IFNB1基因中的3'外顯子-內(nèi)含子連接相鄰。比較性IFNB1引物的Primer-BLAST搜索顯示,表1中列出的25堿基對(duì)IFNB1正向引物和26堿基對(duì)IFNB1反向引物結(jié)合到3'外顯子-內(nèi)含子的IFNB1位置。這些比較性IFNB1引物的長(zhǎng)度略長(zhǎng)于36B4(RPLP0)引物,原始先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定中使用的長(zhǎng)度為23 bp的正向引物和25 bp的反向引物,并且略長(zhǎng)于PCR賊佳實(shí)踐中建議的18-24 bp。

此外,比較性IFNB1正向引物的熔解溫度(Tm)為78°C(G/C = 14 × 4;A/T = 11 × 2),而比較性IFNB1反向引物的熔解溫度(Tm)為78°C(G/C = 13 × 4;A/T = 13 × 2)。盡管兩個(gè)引物的熔解溫度相差不超過(guò)5°C,但比較性IFNB1引物違反了良好PCR設(shè)計(jì)的原則,因?yàn)樗鼈兊娜劢鉁囟龋═m)未在50°C至60°C之間。

圖1. IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度基因檢測(cè)方案的的生物信息學(xué)分析 a)比較性IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度雙鏈寡聚體標(biāo)準(zhǔn),b)與比較性IFNB1反義寡聚體形成發(fā)夾環(huán),c)替代IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度雙鏈寡聚體標(biāo)準(zhǔn)。

此外,比較性IFNB1反義寡聚體序列中的GTGT二核苷酸重復(fù)區(qū)域允許形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1b)。寡聚體發(fā)夾環(huán)的形成可能會(huì)降低比較性IFNB1反義寡聚體的擴(kuò)增效率,導(dǎo)致使用比較性IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算基因組拷貝數(shù)時(shí)出現(xiàn)不正確的情況。當(dāng)在任何端粒長(zhǎng)度測(cè)定中使用比較性IFNB1單拷貝基因測(cè)定時(shí),這將導(dǎo)致對(duì)任何測(cè)試樣本的二倍體拷貝數(shù)計(jì)算的不正確性。

基因信息分析

進(jìn)一步進(jìn)行了遺傳學(xué)分析以驗(yàn)證對(duì)比性IFNB1單拷貝基因先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法的生物信息學(xué)評(píng)估正確性,使用表2中列出的IFNB1 qPCR條件進(jìn)行了遺傳學(xué)分析。表2還列出了使用同一DNA樣本等體積進(jìn)行測(cè)定端粒重復(fù)序列數(shù)的qPCR條件。佳學(xué)基因?qū)⑦@些結(jié)果與使用36B4(RPLP0)qPCR測(cè)定得到的結(jié)果進(jìn)行了比較。值得注意的是,一些機(jī)構(gòu)IFNB1 qPCR測(cè)定未列出環(huán)形質(zhì)粒DNA(pBR322)的添加,而36B4(RPLP0)先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定中添加了環(huán)形質(zhì)粒DNA(pBR322)以保持每個(gè)端粒和36B4(RPLP0)寡聚體濃度下反應(yīng)體系中總DNA的恒定量,用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案的過(guò)程中, 佳學(xué)基因按照表2中列出的無(wú)質(zhì)粒的比較性IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行分析。值得注意的是,一些機(jī)構(gòu)采用比較性IFNB1 qPCR的條件采用了三步法的qPCR循環(huán)條件,包括50 °C 2分鐘,95 °C 15分鐘的啟動(dòng)步驟,然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)包括95 °C 15秒,60 °C 1分鐘,以及一個(gè)72 °C 30秒的延伸步驟(表2),同時(shí)適用于端粒重復(fù)序列和比較性IFNB1單拷貝基因的qPCR。從這些條件與原始的36B4(RPLP0)先進(jìn)端粒長(zhǎng)度 qPCR運(yùn)行條件(95 °C 10分鐘,然后40個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)包括95 °C 15秒,60 °C 1分鐘,隨后進(jìn)行熔解曲線)的比較中可以看出這是一個(gè)變化。因此,佳學(xué)基因端?;驒z測(cè)在分析中使用了兩步法的qPCR擴(kuò)增方案,36B4(RPLP0)測(cè)定采用60 °C退火溫度,比較性IFNB1 qPCR(無(wú)質(zhì)粒)實(shí)驗(yàn)方案采用了三步法的qPCR擴(kuò)增方案,包括60 °C退火和72 °C延伸步驟(表2)。為了觀察到賊稀釋的比較性IFNB1標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增情況,還將比較性IFNB1單拷貝基因測(cè)定的PCR循環(huán)次數(shù)從40次延長(zhǎng)到了45次。

36B4(RPLP0)和比較性IFNB1單拷貝基因qPCR測(cè)定的結(jié)果如表3、表4和表5所示。通常情況下,標(biāo)準(zhǔn)曲線的10倍稀釋應(yīng)該得到ΔCt值在-3.60到-3.10個(gè)循環(huán)之間,反映每個(gè)qPCR循環(huán)中寡核苷酸模板翻倍2倍,PCR效率在90%到110%之間。表5中呈現(xiàn)的結(jié)果表明,對(duì)于36B4(RPLP0)寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度,這種情況確實(shí)存在,得到了中位數(shù)(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)的ΔCt值為-3.20(±0.05),PCR效率為1.05(或105%),R2為0.99990。相反,表3表明,無(wú)論是使用帶質(zhì)粒的比較性IFNB1 qPCR擴(kuò)增方案還是不帶質(zhì)粒的比較性IFNB1 qPCR擴(kuò)增方案,當(dāng)10倍稀釋比較性IFNB1寡核苷酸時(shí),沒(méi)有反映出寡核苷酸的兩倍增加,對(duì)于不帶質(zhì)粒的三步法比較性IFNB1 qPCR測(cè)定,得到了中位數(shù)(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)的ΔCt值為-1.91(±1.53)。不帶質(zhì)粒的比較性IFNB1 qPCR測(cè)定的PCR效率為2.33(或233%),R2為0.868(表3)。這些結(jié)果與部分基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)的比較研究中的結(jié)果相似(分別為1.987和0.999319;表3)。這個(gè)結(jié)果可能是由于寡核苷酸發(fā)夾環(huán)隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的,從而減少了可用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的寡核苷酸。增加PCR退火溫度或在分析中使用更高濃度的寡核苷酸或DNA可能會(huì)改善比較性IFNB1單拷貝基因測(cè)定。有趣的是,這種使用10倍稀釋的比較性IFNB1寡核苷酸的循環(huán)數(shù)差異與不帶質(zhì)粒的比較端粒(三步法)qPCR測(cè)定中并不相關(guān),得到了中位數(shù)(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)的ΔCt值為-3.36(±0.61),PCR效率為0.99,R2為0.99(表3),而與Hastings等人(2022年)的研究中列出的PCR效率為2.0465,R2為0.999102的結(jié)果相比。使用質(zhì)粒的端粒(兩步法)qPCR測(cè)定也得到了類似的結(jié)果(表4)。

表3. 使用不含質(zhì)粒的比較IFNB1(三步)qPCR方案計(jì)算端粒長(zhǎng)度

Sample ID Telomere Ct SD Single Copy Gene Ct SD Relative 端粒長(zhǎng)度 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度
2–ΔCt LN (2–ΔCt) T/S (kbp)
Females (mean)           5.31 5.21
Saliva DNA A 14.73 0.03 23.21 0.05 359.54 5.88 5.10
Saliva DNA B 16.27 0.00 23.67 0.02 170.07 5.14 3.23
Saliva DNA C 16.64 0.06 24.41 0.03 219.79 5.39 6.60
Whole Blood DNA C 17.15 0.01 24.59 0.07 173.65 5.16 5.86
Whole Blood DNA B 17.50 0.04 24.70 0.03 147.03 4.99 5.29
Males (mean)           5.10 4.30
Saliva DNA A 16.06 0.05 23.89 0.05 222.86 5.41 4.87
Saliva DNA B 16.04 0.04 23.35 0.03 159.79 5.07 2.50
Saliva DNA C 16.48 0.05 23.81 0.04 157.59 5.06 3.27
Whole Blood DNA C 17.62 0.04 24.87 0.03 153.28 5.03 6.17
Whole Blood DNA B 17.56 0.10 24.64 0.10 135.30 4.91 4.70
Jurkat DNA (short telomere) 17.45 0.01 26.27 0.02 451.94 6.11 4.22
ΔCt average for standards −3.36   −1.91        
R2 0.99   0.87        
PCR efficiency 0.99   2.33        

表4. 使用含質(zhì)粒的比較IFNB1(兩步)qPCR方案計(jì)算端粒長(zhǎng)度

Sample ID Telomere Ct SD Single Copy Gene Ct SD Relative 端粒長(zhǎng)度 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度
2–ΔCt LN (2–ΔCt) T/S (kbp)
Females (mean)           6.72 5.65
Saliva DNA A 14.61 0.03 25.59 0.01 147.03 7.94 2.47
Saliva DNA B 15.79 0 25.54 0.03 2797.65 6.40 5.04
Saliva DNA C 16.28 0.03 26.40 0.03 600.49 6.74 10.90
Whole Blood DNA C 17.00 0.01 26.27 0.08 849.22 6.36 5.72
Whole Blood DNA B 17.74 0.04 26.40 0.03 576.03 6.15 4.11
Males (mean)           6.33 6.15
Saliva DNA A 15.84 0.03 25.70 0.06 797.86 6.68 5.98
Saliva DNA B 15.88 0.02 25.13 0.04 541.19 6.29 2.80
Saliva DNA C 16.27 0.02 25.59 0.05 552.56 6.31 3.91
Whole Blood DNA C 17.61 0.04 26.54 0.03 487.75 6.19 5.34
Whole Blood DNA B 16.22 0.10 26.49 0.10 487.75 6.19 12.70
Jurkat DNA (short telomere) 17.45 0.01 26.27 0.02 451.94 6.11 4.22
ΔCt average for standards −3.45   −1.83        
R2 1.00   0.89        
PCR efficiency 0.95   2.53        

表5. 使用含質(zhì)粒的36B4(兩步)qPCR方案計(jì)算端粒長(zhǎng)度

Sample ID Telomere Ct SD Single Copy Gene Ct SD Relative 端粒長(zhǎng)度 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度
2–ΔCt LN (2–ΔCt) T/S (kbp)
Females (mean)           3.22 4.23
Saliva DNA A 14.61 0 19.77 0.04 35.75 3.58 5.40
Saliva DNA B 15.79 0 20.54 0.04 26.91 3.29 4.29
Saliva DNA C 16.28 0.01 21.24 0.02 31.12 3.44 5.16
Whole Blood DNA C 17.00 0.06 21.48 0.03 22.32 3.11 3.79
Whole Blood DNA B 17.74 0.06 21.60 0 14.52 2.68 2.53
Males (mean)           3.34 4.54
Saliva DNA A 15.84 0.03 20.81 0.05 50.91 3.93 5.03
Saliva DNA B 15.88 0.02 20.33 0.06 21.86 3.08 3.46
Saliva DNA C 16.27 0.02 20.6 0.05 20.11 3.00 3.26
Whole Blood DNA C 17.61 0.03 21.74 0.04 17.51 2.86 3.04
Whole Blood DNA B 16.22 0.10 21.77 0.10 46.85 3.85 7.92
Jurkat DNA (short telomere) 17.45 0.01 22.04 0.03 24.08 3.18 4.22
ΔCt average for standards −3.45   −3.20        
R2 1.00   1.00        
PCR efficiency 0.95   1.05        

佳學(xué)基因還在每個(gè)比較性IFNB1寡核苷酸稀釋液中添加了3 ng的圓形質(zhì)粒DNA(pBR322),然后再次運(yùn)行了兩步法qPCR實(shí)驗(yàn)方案的比較性IFNB1 qPCR測(cè)定。將改變后的比較性IFNB1 qPCR測(cè)定方法的結(jié)果呈現(xiàn)在表4中。在為每個(gè)比較性IFNB1寡核苷酸稀釋液添加質(zhì)粒DNA,并執(zhí)行兩步法qPCR實(shí)驗(yàn)方案后,與不帶質(zhì)粒的三步法相比,得到了類似的結(jié)果,中位數(shù)ΔCt(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)為-1.83(±1.53),反映了PCR效率為2.53和R2為0.89(表4)。端粒重復(fù)序列qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線給出了中位數(shù)ΔCt(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)為-3.452(±0.60),PCR效率為0.99990,R2為0.95。正是端粒(帶或不帶質(zhì)粒)qPCR的結(jié)果支持了在生成標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)比較性IFNB1寡核苷酸發(fā)夾環(huán)的形成對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響的這一基因解碼結(jié)果。

使用雙鏈DNA濃度測(cè)定法生成了一個(gè)大樣本(300μL)的0.5 ng/μL DNA稀釋液,該樣本來(lái)自唾液和全血提取的DNA,并使用表2中列出的端粒重復(fù)、比較性IFNB1和36B4 (RPLP0)單拷貝基因qPCR檢測(cè)方案進(jìn)行擴(kuò)增。這些分析的結(jié)果也在表3、表4和表5中呈現(xiàn)。表3和表4中列出的比較性IFNB1單拷貝基因的結(jié)果未顯示唾液的平均端粒長(zhǎng)度長(zhǎng)于血液白細(xì)胞。相反,使用36B4 (RPLP0)單拷貝基因的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定顯示唾液中提取的DNA相比血液白細(xì)胞DNA具有更長(zhǎng)的端粒長(zhǎng)度(表5)。表5還顯示,在使用36B4 (RPLP0)單拷貝基因時(shí),男性(平均:4.54)比女性(平均:4.23)參與者具有更長(zhǎng)的端粒長(zhǎng)度,而使用比較性IFNB1單拷貝基因時(shí)則相反(表3、表4)。表3顯示,相比于使用比較性IFNB1單拷貝基因(兩步法)(顯示男性的端粒長(zhǎng)度長(zhǎng)于女性),使用比較性IFNB1單拷貝基因(三步法)時(shí),女性具有更長(zhǎng)的端粒長(zhǎng)度(表4)。這些結(jié)果無(wú)論是使用相對(duì)或先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法進(jìn)行分析,都與比較性IFNB1(無(wú)質(zhì)粒)qPCR測(cè)定結(jié)果一致。

圖2. 使用沒(méi)有添加質(zhì)粒(pBR322)的三步PCR方案進(jìn)行的遺傳分析。a)端粒qPCR檢測(cè)方法,b)比較IFNB1 qPCR檢測(cè)方法。

 

圖3. 使用添加了質(zhì)粒(pBR322)的兩步qPCR方案進(jìn)行的遺傳分析。a)端粒qPCR檢測(cè)方法,b)比較IFNB1 qPCR檢測(cè)方法,c)替代IFNB1 qPCR檢測(cè)方法,d)36B4 qPCR檢測(cè)方法。

對(duì)比較性IFNB1測(cè)定的三步法和兩步法的解離曲線進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn),無(wú)論使用哪種實(shí)驗(yàn)方案,非模板對(duì)照(NTC)樣本中均可觀察到高于背景的峰值(圖2b和3b)。比較性IFNB1單拷貝基因測(cè)定相關(guān)的擴(kuò)增曲線和解離曲線中都可以看到超過(guò)背景水平的NTC峰值。而在使用36B4 (RPLP0)單拷貝基因時(shí),解離曲線中未觀察到NTC峰值(圖3d)。36B4 (RPLP0)單拷貝基因的擴(kuò)增曲線確實(shí)顯示了一個(gè)峰值,但該峰值的高度未超過(guò)擴(kuò)增曲線開(kāi)始時(shí)的背景水平(圖3d)。

無(wú)論是否使用質(zhì)粒,評(píng)估端粒重復(fù)序列的解離曲線都顯示出非模板對(duì)照(NTC)樣本的小峰值(圖2a和3a)。無(wú)質(zhì)粒的三步法協(xié)議在解離曲線中顯示出比含質(zhì)粒的兩步法更高的NTC峰值(圖2a和3a)。此外,無(wú)論是否含質(zhì)粒,端粒重復(fù)序列的擴(kuò)增曲線也顯示出一個(gè)峰值,但含質(zhì)粒的兩步法峰值的高度不如去除質(zhì)粒并增加退火溫度時(shí)觀察到的擴(kuò)增曲線開(kāi)始處的背景水平(圖2b和3b)。無(wú)論使用哪種實(shí)驗(yàn)方案,端粒區(qū)域的擴(kuò)增中還可以發(fā)現(xiàn)兩個(gè)額外的峰值。這是由于寡核苷酸與基因組DNA之間G/C序列穩(wěn)定性差異引起的多級(jí)熔解轉(zhuǎn)變。因此,產(chǎn)生具有多個(gè)峰值的熔解曲線可以視為一種成功的qPCR測(cè)定方法。
 

替代的 IFNB1 單拷貝基因 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度 分析

考慮到使用比較性 IFNB1 單拷貝基因分析時(shí)所觀察到的困難,佳學(xué)基因還測(cè)試了一種替代的 IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度 單拷貝基因分析,目標(biāo)是位于染色體9上的 IFNB1 基因的 5' UTR 區(qū)域。這種替代的 IFNB1 單拷貝基因 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度 分析針對(duì)的是與先前發(fā)表的 IFNB1 相對(duì) 端粒長(zhǎng)度 分析相似的 IFNB1 引物區(qū)域。

生物信息學(xué)分析

對(duì)于在圖1c)中展示的寡核苷酸,進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。分析結(jié)果顯示,該寡核苷酸是一個(gè)82堿基對(duì)的雙鏈寡核苷酸模板,用于引物結(jié)合以生成已知二倍體拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。這個(gè)雙鏈寡核苷酸的長(zhǎng)度略長(zhǎng)于36B4(RPLP0)先進(jìn)端粒長(zhǎng)度分析中使用的75 bp雙鏈寡核苷酸,但仍在建議的75-150 bp目標(biāo)序列長(zhǎng)度范圍內(nèi),符合良好PCR實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。使用UCSC基因組瀏覽器的Blat搜索(Kent, 2002),對(duì)替代的IFNB1雙鏈寡核苷酸序列進(jìn)行分析,結(jié)果表明這個(gè)82堿基對(duì)的雙鏈寡核苷酸模板只位于IFNB1基因座的染色體9p21.3位置,該區(qū)域沒(méi)有序列變異或重復(fù)區(qū)域。

圖1c)還展示了用于這種替代IFNB1單拷貝基因分析的前向和反向引物,這些引物以G/C堿基對(duì)開(kāi)始和結(jié)束引物序列,從而通過(guò)GC氫鍵夾持增強(qiáng)引物的穩(wěn)定性。對(duì)替代IFNB1引物進(jìn)行的Primer-BLAST搜索顯示,這兩個(gè)引物分別為21堿基對(duì)的替代IFNB1前向引物和22堿基對(duì)的替代IFNB1反向引物,它們與這個(gè)替代IFNB1位置相結(jié)合。這兩個(gè)引物的長(zhǎng)度略短于原始先進(jìn)端粒長(zhǎng)度分析中使用的23 bp前向引物和25 bp反向引物,但仍然在18-24 bp的良好設(shè)計(jì)PCR協(xié)議所要求的長(zhǎng)度范圍內(nèi)。此外,前向引物的熔解溫度(Tm)為62 °C(G/C = 10 × 4; A/T = 11 × 2),而反向引物的熔解溫度(Tm)為60 °C(G/C = 8 × 4; A/T = 14 × 2)。替代IFNB1引物的熔解溫度相差不超過(guò)5 °C,并且在50 °C到60 °C之間,符合PCR實(shí)驗(yàn)方案的引物設(shè)計(jì)的要求。

Primer-Blast搜索還顯示,替代IFNB1前向引物與位于染色體20上的鋅指SWIM類型(ZSWIM3)轉(zhuǎn)錄本具有同源性。在檢查這個(gè)匹配時(shí),發(fā)現(xiàn)這個(gè)21堿基對(duì)的前向引物將在這個(gè)開(kāi)放閱讀框164(SWIM3)位置的兩個(gè)區(qū)域之間相隔1,307堿基對(duì)結(jié)合兩次。雖然在這兩個(gè)區(qū)域中IFNB1前向引物有5個(gè)核苷酸是非同源的(附圖2),但在相隔1,307個(gè)堿基的兩個(gè)區(qū)域中,擴(kuò)增會(huì)需要額外的時(shí)間在延伸步驟中進(jìn)行。由于在使用校對(duì)聚合酶時(shí)不建議使用超過(guò)推薦延伸時(shí)間,而QuantiTect SYBR Green Master Mix(Qiagen)中的Qiagen HotStarTaq DNA聚合酶是一種高保真度的熱啟動(dòng)校對(duì)酶,使用替代IFNB1前向引物擴(kuò)增額外的SWIM3區(qū)域在兩步法qPCR實(shí)驗(yàn)方案中,其中退火和延伸步驟結(jié)合在一起,會(huì)更加困難。因此,佳學(xué)基因認(rèn)為替代IFNB1前向和反向引物只會(huì)結(jié)合并擴(kuò)增其指定的位置,如圖1c)所示,并且不會(huì)結(jié)合到基因組的任何其他區(qū)域或任何其他基因組位置。

為了測(cè)試替代IFNB1 qPCR方案的生物信息學(xué)評(píng)估正確性,進(jìn)行了另一項(xiàng)遺傳學(xué)分析,如表2所示。該遺傳學(xué)分析使用了與36B4 (RPLP0)相似的兩步法,在60 °C退火的條件下進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,以創(chuàng)建替代IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用替代IFNB1寡核苷酸稀釋的10倍稀釋物獲得的平均Ct值反映了每個(gè)PCR循環(huán)中寡核苷酸模板的兩倍增加,通過(guò)獲得ΔCt均值(± SD)為-3.60(±0.22)個(gè)周期數(shù)(表6),表明斜率在-3.1和-3.6之間,通常適用于大多數(shù)需要正確定量的應(yīng)用。替代IFNB1擴(kuò)增的PCR效率也為0.9或90%,R2為0.99942(表6)。

表6:使用替代IFNB1(兩步法)qPCR方案計(jì)算端粒長(zhǎng)度(含質(zhì)粒)。

Sample ID Telomere Ct SD Single Copy Gene Ct SD Relative 端粒長(zhǎng)度 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度
2–ΔCt LN (2–ΔCt) T/S (kbp)
Females (mean)           6.33 5.69
Saliva DNA A 14.61 0 24.54 0.03 975.50 6.88 9.41
Saliva DNA B 15.79 0 25.09 0.08 630.35 6.45 6.05
Saliva DNA C 16.28 0.01 25.30 0.08 519.15 6.25 5.01
Whole Blood DNA C 17.00 0.06 25.83 0.00 455.09 6.12 4.30
Whole Blood DNA B 17.74 0.06 25.35 0.09 390.72 5.97 3.66
Males (mean)           6.48 6.34
Saliva DNA A 15.84 0.03 25.44 0.02 776.05 6.65 7.30
Saliva DNA B 15.88 0.02 24.91 0.01 522.76 6.26 5.05
Saliva DNA C 16.27 0.02 25.63 0.01 657.11 6.49 6.20
Whole Blood DNA C 17.61 0.03 26.35 0.03 427.57 6.06 3.98
Whole Blood DNA B 16.22 0.10 26.20 0.07 1009.90 6.92 9.15
Jurkat DNA (short telomere) 17.45 0.01 26.27 0.02 451.94 6.11 4.22
ΔCt average for standards −3.45   −3.60        
R2 1.00   1.00        
PCR efficiency 0.95   0.90        

對(duì)替代IFNB1 qPCR方案的解離曲線進(jìn)行評(píng)估顯示,在非模板對(duì)照(NTC)樣本中存在一個(gè)峰值(圖3c)。與36B4(RPLP0)單拷貝基因類似,替代IFNB1單拷貝基因的擴(kuò)增曲線顯示該峰值不超過(guò)擴(kuò)增曲線開(kāi)始時(shí)的背景水平,因此在解離曲線中沒(méi)有顯示出來(lái)(圖3c)。

使用替代IFNB1單拷貝基因的qPCR生成的端粒長(zhǎng)度結(jié)果是使用與36B4(RPLP0)qPCR分析相同的0.5 ng/uL唾液和全血DNA的子樣進(jìn)行的(表5)。表6列出的端粒長(zhǎng)度結(jié)果顯示,與血液DNA相比,從唾液中提取的DNA在使用替代IFNB1單拷貝基因時(shí)具有更長(zhǎng)的平均端粒長(zhǎng)度。表6還顯示,當(dāng)使用替代IFNB1單拷貝基因分析時(shí),男性(平均值:6.34)比女性(平均值:5.69)參與者具有更長(zhǎng)的端粒長(zhǎng)度。

為了展示使用替代IFNB1 qPCR方案作為單拷貝基因的重復(fù)性,佳學(xué)基因再次分析了來(lái)自另外一名女性和男性參與者的唾液和全血DNA樣本,將分析樣本的數(shù)量增加到15名參與者,并計(jì)算了ICC值進(jìn)行重新分析。分析這些結(jié)果(CI = 0.90)顯示該檢測(cè)具有良好的重復(fù)性,獲得相對(duì)端粒長(zhǎng)度分析的ICC(±SD)為0.936(±0.06),先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法的ICC(±SD)為0.897(±0.09)(CI 0.90)(表7)。佳學(xué)基因還繪制了年齡與先進(jìn)端粒長(zhǎng)度結(jié)果之間的相關(guān)性散點(diǎn)圖。賊佳擬合線顯示了年齡與先進(jìn)端粒長(zhǎng)度結(jié)果之間的反向關(guān)系。該單拷貝基因檢測(cè)能夠顯示年齡較小的參與者具有較長(zhǎng)的端粒長(zhǎng)度,而年齡較大的參與者則具有較短的端粒長(zhǎng)度(圖4)。

表7. 使用含質(zhì)粒的替代IFNB1(兩步)qPCR方案進(jìn)行的重復(fù)性研究

 

(a) 進(jìn)行端粒和替代IFNB1 qPCR檢測(cè)的先進(jìn)批結(jié)果

Sample ID Telomere Ct SD Single Copy Gene Ct SD Relative 端粒長(zhǎng)度 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度
2–ΔCt LN (2–ΔCt) T/S (kbp)
Females (mean)             5.60
Saliva DNA 1 14.61 0 25.28 0 1629.26 7.40 9.83
Saliva DNA 2 15.79 0 25.63 0.05 916.51 6.82 5.60
Saliva DNA 3 16.28 0.01 25.99 0.06 837.53 6.73 5.13
Saliva DNA 4 15.59 0.01 25.56 0.01 1002.93 6.91 6.35
Whole Blood DNA 4 15.80 0.04 25.59 0.07 885.29 6.79 5.57
Whole Blood DNA 3 17.00 0.06 26.33 0.10 643.59 6.47 3.95
Whole Blood DNA 2 17.74 0.06 26.77 0.10 522.76 6.26 3.19
Males (mean)             6.28
Saliva DNA 1 15.84 0.03 26.03 0.02 1168.14 7.06 7.02
Saliva DNA 2 15.88 0.02 25.61 0.02 849.22 6.74 5.21
Saliva DNA 3 16.27 0.02 26.25 0.01 1009.90 6.92 6.08
Saliva DNA 4 15.68 0.04 25.72 0.09 1052.79 6.96 6.58
Whole Blood DNA 4 17.25 0.04 26.35 0.01 548.75 6.31 5.45
Whole Blood DNA 3 17.61 0.03 26.98 0.01 661.68 6.49 3.98
Whole Blood DNA 2 16.22 0.10 26.91 0.07 1652.00 7.41 9.62
Jurkat DNA (short telomere) 17.45 0.01 26.90 0.04 699.40 6.55 4.22
ΔCt average for standards −3.45   −3.41        
R2 1.00   1.00        
PCR efficiency 0.95   0.90        

(b) 進(jìn)行端粒和替代IFNB1 qPCR檢測(cè)的第二批結(jié)果。

Females (mean)             7.12
Saliva DNA 1 14.61 0 25.33 0 1686.71 7.43 13.25
Saliva DNA 2 15.79 0 25.73 0.09 982.29 6.89 7.09
Saliva DNA 3 16.28 0.01 26.18 0.10 955.43 6.86 6.48
Saliva DNA 4 15.39 0.05 25.80 0.01 1360.57 7.22 9.09
Whole Blood DNA 4 15.96 0.07 25.59 0.07 792.35 6.68 5.81
Whole Blood DNA 3 17.00 0.06 26.49 0.06 719.08 6.58 4.59
Whole Blood DNA 2 17.74 0.06 26.96 0.10 596.34 6.39 3.54
Males (mean)             7.00
Saliva DNA 1 15.75 0.09 26.07 0.02 1278.29 7.15 8.96
Saliva DNA 2 15.88 0.02 25.66 0.02 879.17 6.78 6.33
Saliva DNA 3 16.27 0.02 26.24 0.08 1002.93 6.91 6.76
Saliva DNA 4 15.79 0.02 25.72 0.09 975.50 6.88 6.73
Whole Blood DNA 4 16.80 0.08 26.37 0.01 760.08 6.63 5.11
Whole Blood DNA 3 17.61 0.03 27.08 0.09 709.18 6.56 4.17
Whole Blood DNA 2 16.22 0.19 26.96 0.07 1710.26 7.44 10.97
Jurkat DNA (short telomere) 17.45 0.01 26.90 0.04 699.40 6.55 4.22
ΔCt average for standards −3.16   −3.64        
R2 0.99   1.00        
PCR efficiency 1.07   0.88
 

Sample ID
Telomere Ct SD Single Copy Gene Ct SD Relative 端粒長(zhǎng)度 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度
2–ΔCt LN (2–ΔCt) T/S (kbp)

圖4. 使用替代IFNB1單拷貝基因進(jìn)行先進(jìn)端粒長(zhǎng)度分析的年齡和端粒長(zhǎng)度(端粒長(zhǎng)度)的散點(diǎn)圖。

佳學(xué)基因年輕態(tài)基因檢測(cè)的方法學(xué)分析

IFNB1基因在人類和小鼠中僅編碼一個(gè)基因。曾引入了針對(duì)IFNB1的單拷貝基因修飾,用于使用相對(duì)端粒長(zhǎng)度 qPCR分析測(cè)量端粒長(zhǎng)度。其他相對(duì)端粒長(zhǎng)度的研究發(fā)表后也采用了該IFNB1 qPCR方法來(lái)獲得相對(duì)端粒長(zhǎng)度結(jié)果。相反,在先進(jìn)端粒長(zhǎng)度(先進(jìn)端粒長(zhǎng)度)qPCR分析中使用IFNB1作為單拷貝基因的結(jié)果一直缺乏,直到佳學(xué)基因所進(jìn)行一項(xiàng)比較研究現(xiàn),在兒童隊(duì)列中的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度和DNAm端粒長(zhǎng)度端粒長(zhǎng)度結(jié)果之間存在不一致。

佳學(xué)基因的細(xì)胞年輕態(tài)端?;驒z測(cè)方法學(xué)比較指出了幾個(gè)可能的原因。佳學(xué)基因的比較研究選擇了Qiagen HotStarTaq DNA聚合酶,該酶存在于QuantiTect SYBR Green Master Mix(Qiagen)中,用于更長(zhǎng)的延伸時(shí)間和選擇三步qPCR方案來(lái)比較先進(jìn)端粒長(zhǎng)度和DNAm端粒長(zhǎng)度分析中的端粒長(zhǎng)度。鑒于使用證據(jù)酶時(shí)不建議超過(guò)推薦的延伸時(shí)間,因此在比較的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度研究中選擇了這種酶用于三步PCR程序。先前的研究也指出,與三步PCR方案相比,兩步PCR方案更適合擴(kuò)增短串聯(lián)重復(fù)序列,例如端粒重復(fù)區(qū)域。

端粒長(zhǎng)度的結(jié)果在比較IFBNB1和DNAm端粒長(zhǎng)度研究之間的不一致可能還源于在生成標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)未包括圓形雙鏈DNA質(zhì)粒(pBR322),以維持每個(gè)反應(yīng)管中總DNA的恒定量。去除這種循環(huán)DNA將改變DNA模板濃度,從而改變其鎖定的鎂離子濃度(Henegariu et al., 1997)。鎂是熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶高效工作所必需的輔因子(Altshulder, 2006)。本研究的結(jié)果顯示,去除圓形質(zhì)粒DNA來(lái)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線可能會(huì)導(dǎo)致QuantiTect SYBR Green Master Mix(Qiagen)中游離鎂離子濃度的增加,降低高保真HotstarTaq DNA聚合酶的正確性,從而增加非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)量(Altshulder, 2006)。這在端粒重復(fù)序列qPCR分析的NTC樣本中表現(xiàn)得賊為明顯,其中在擴(kuò)增曲線中觀察到了非特異性產(chǎn)物的輕微增加,以及三步端粒重復(fù)序列qPCR方案的解離曲線中的峰值(Fig. 2b和3b)。然而,通過(guò)去除圓形質(zhì)粒DNA來(lái)改變鎂離子濃度似乎不會(huì)影響比較IFNB1單拷貝基因qPCR分析中NTC樣本中引物二聚體形成或誤引物結(jié)合的概率。無(wú)論是否使用兩步或三步方案進(jìn)行qPCR分析,該NTC樣本的解離曲線中都可以觀察到與已測(cè)試樣本高度相等的峰值,而不受質(zhì)粒狀態(tài)的影響(Fig. 2b和3b)。

因此,可以假設(shè)在比較IFNB1 qPCR分析中生成了兩個(gè)以上的目標(biāo)序列拷貝。對(duì)比IFNB1引物和寡核苷酸分析的生物信息學(xué)結(jié)果(Hastings等人,2022)進(jìn)一步說(shuō)明了導(dǎo)致比較IFNB1研究中產(chǎn)生兩個(gè)以上拷貝的原因。生物信息學(xué)結(jié)果顯示,在比較IFNB1前向引物的末端發(fā)現(xiàn)的二核苷酸重復(fù)可能導(dǎo)致與反義寡核苷酸中的非同源結(jié)合,從而生成比較IFNB1前向引物的非特異性引物,如圖1a所示。通過(guò)添加5個(gè)堿基以匹配真實(shí)位置,將在正義寡核苷酸鏈上與前向引物非特異性結(jié)合的二核苷酸重復(fù)生成一個(gè)34堿基的非特異性引物產(chǎn)物,其中前向引物在反義寡核苷酸中間的二核苷酸重復(fù)位置非特異性結(jié)合,并懸掛了21堿基。無(wú)論使用兩步還是三步qPCR協(xié)議,都會(huì)在NTC樣本的解離曲線中產(chǎn)生熔解曲線,如圖2b和3b所示。

此外,對(duì)比IFNB1 qPCR寡核苷酸的生物信息學(xué)分析顯示形成了發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu),這可能限制反義寡核苷酸濃度的擴(kuò)增,并導(dǎo)致比較IFNB1熔解曲線(圖2b和3b)中的峰值高度較36B4(RPLP0)熔解曲線(圖3d)低。比較IFNB1寡核苷酸的濃度減少,無(wú)論是否添加pBR322質(zhì)粒,都將導(dǎo)致全血和唾液DNA樣本的位置偏離其相應(yīng)的比較IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線區(qū)域,如圖2b和3b所示。由于發(fā)夾環(huán)的形成(圖1b),進(jìn)一步稀釋比較IFNB1寡核苷酸濃度來(lái)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,即使進(jìn)行額外的PCR循環(huán),也不會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物翻倍。比較IFNB1前向引物與二核苷酸重復(fù)末端的非特異性引物形成(圖1a)還阻止了100%的PCR效率。因此,為了避免稀釋樣本中出現(xiàn)隨機(jī)效應(yīng)(https://biosistemika.com/blog/qpcr-efficiency-over-100/)并確保被測(cè)試的DNA樣本位于比較IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi),比較IFNB1寡核苷酸和被測(cè)試樣本的DNA濃度需要更高。這種增加寡核苷酸濃度的需求與36B4(RPLP0)先進(jìn)端粒長(zhǎng)度分析中的情況類似,導(dǎo)致擴(kuò)增曲線向較低的Ct值偏移。

本研究中比較IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度無(wú)質(zhì)粒的PCR效率為2.33(或233%),與Hastings等人(2022)研究中列出的端粒和單拷貝基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的可接受PCR效率為1.8到2.0(10%變異)類似,相當(dāng)于180-200%。由于期望的PCR效率范圍在90%至110%之間,理論上的賊大值為100%,表示DNA聚合酶正以賊大效率工作(https://biosistemika.com/blog/qpcr-efficiency-over-100/),而180-200%的更高效率表明每個(gè)比較IFNB1 qPCR循環(huán)產(chǎn)生超過(guò)兩個(gè)目標(biāo)序列的拷貝(Table 3)。每個(gè)PCR循環(huán)中產(chǎn)生超過(guò)兩個(gè)拷貝可能會(huì)導(dǎo)致為每個(gè)比較IFNB1寡核苷酸稀釋計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)的更高ΔCt平均值。正如Hastings等人(2022)的比較IFNB1單拷貝(ΔCt平均值=-1.91)所示(表3)。這種過(guò)高估計(jì)的二倍體拷貝數(shù)將導(dǎo)致對(duì)于使用比較IFNB1 qPCR方法時(shí)將過(guò)高估計(jì)的二倍體拷貝數(shù)除以端粒重復(fù)數(shù)來(lái)計(jì)算任何被測(cè)試樣本的真實(shí)端粒長(zhǎng)度時(shí)的低估或縮短。在本研究中,使用比較IFNB1單拷貝基因qPCR分析得出的端粒長(zhǎng)度結(jié)果,無(wú)論使用哪種端粒長(zhǎng)度方法,與比較IFNB1單拷貝基因(兩步)qPCR分析相比,女性和男性參與者的平均端粒長(zhǎng)度較低(表2,表3)。端粒長(zhǎng)度的增加可能是由于端粒重復(fù)qPCR分析中非特異性引物在背景上方的減少,從而使得每個(gè)樣本中的端粒重復(fù)數(shù)增加能夠被檢測(cè)到。值得注意的是,本研究中使用的36B4(RPLP0)單拷貝基因qPCR分析也導(dǎo)致了樣本中的端粒長(zhǎng)度較低。無(wú)論是否添加質(zhì)?;蜻x擇哪種PCR協(xié)議,使用比較IFNB1單拷貝基因qPCR會(huì)過(guò)高估計(jì)二倍體拷貝數(shù),這也可以解釋與使用DNAm端粒長(zhǎng)度方法生成的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度結(jié)果進(jìn)行比較時(shí)未發(fā)現(xiàn)的結(jié)果(Hastings等人,2022)。此外,由于36B4(RPLP0)已被證明是一個(gè)具有多個(gè)位置的假基因,在每個(gè)PCR循環(huán)中其拷貝模板將有更大的翻倍。這在通過(guò)先進(jìn)端粒長(zhǎng)度分析生成的端粒長(zhǎng)度低于使用比較IFNB1 qPCR時(shí)得到的端粒長(zhǎng)度中得到證明。

表3和表4中列出的比較IFNB1單拷貝基因的結(jié)果并未顯示任何特定細(xì)胞類型的端粒長(zhǎng)度較其他細(xì)胞類型更長(zhǎng)。相反,表5顯示從唾液中提取的DNA相較于血液中的DNA具有更長(zhǎng)的端粒長(zhǎng)度。表5還顯示,與使用比較IFNB1單拷貝基因相比,使用36B4(RPLP0)單拷貝基因時(shí),女性和男性參與者的端粒長(zhǎng)度較長(zhǎng)(表3,表4)。然而,表3顯示,與使用比較IFNB1單拷貝基因(兩步)相比,女性和男性在使用比較IFNB1單拷貝基因(三步)時(shí)的端粒長(zhǎng)度較長(zhǎng)。這些結(jié)果無(wú)論是使用相對(duì)端粒長(zhǎng)度方法還是先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法進(jìn)行分析都是一致的。需要注意的是,由于樣本數(shù)量較小,對(duì)這些結(jié)果應(yīng)謹(jǐn)慎解讀。 生物信息學(xué)和遺傳學(xué)結(jié)果的累積證據(jù)表明,比較IFNB1單拷貝基因分析與36B4(RPLP0)單拷貝基因分析在為先進(jìn)端粒長(zhǎng)度分析提供正確的二倍體拷貝數(shù)評(píng)估方面相似,這提供了一個(gè)合理的解釋,為什么比較IFNB1的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度分析結(jié)果與DNAm端粒長(zhǎng)度結(jié)果不相關(guān)(Hastings等人,2022)。

因此,佳學(xué)基因提出了一種替代的IFNB1單拷貝基因測(cè)定方法,用作先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法的單拷貝基因測(cè)定方法。將替代IFNB1單拷貝基因的擴(kuò)增和解離曲線與比較IFNB1和36B4(RPLP0)單拷貝基因所獲得的曲線進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn),在替代IFNB1單拷貝基因測(cè)定中,NTC中沒(méi)有產(chǎn)生非特異性引物擴(kuò)增。替代IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果的一致性將真實(shí)反映端粒長(zhǎng)度,當(dāng)將計(jì)算得到的二倍體拷貝數(shù)除以每個(gè)測(cè)試樣品的端粒重復(fù)序列時(shí),不會(huì)延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度。實(shí)際上,佳學(xué)基因端?;驒z測(cè)先進(jìn)端粒長(zhǎng)度結(jié)果的散點(diǎn)圖顯示了年齡與端粒長(zhǎng)度之間預(yù)期的反向關(guān)系,即端粒長(zhǎng)度隨年齡減少(圖4)。為了展示這種單拷貝基因測(cè)定作為可重復(fù)使用的方法,佳學(xué)基因再次分析了來(lái)自額外的女性和男性參與者的唾液和全血樣品,使得樣品數(shù)達(dá)到了15個(gè)參與者。對(duì)這些結(jié)果的分析顯示,該測(cè)定提供了相對(duì)端粒長(zhǎng)度分析的ICCs(± SD)為0.936(± 0.06)(CI 0.90),先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法的ICC(± SD)為0.897(± 0.09)(CI 0.90)。替代IFNB1單拷貝基因先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定的優(yōu)勢(shì)在于能夠提供一個(gè)中位數(shù)ΔCt值為-3.60的標(biāo)準(zhǔn)曲線,相當(dāng)于每個(gè)PCR循環(huán)中的拷貝數(shù)增加兩倍,反應(yīng)效率為90%。這對(duì)于大多數(shù)需要正確定量的應(yīng)用來(lái)說(shuō)是可接受的。比較IFNB1單拷貝基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線無(wú)論使用何種PCR基因檢測(cè),都未反映出這種可接受的拷貝數(shù)增加兩倍,每個(gè)周期都如此(表3)。當(dāng)使用替代IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),10倍稀釋的拷貝基因濃度始終能提供更高的二倍體拷貝數(shù),從而真實(shí)反映出先進(jìn)端粒長(zhǎng)度,而在計(jì)算得到的二倍體拷貝數(shù)除以每個(gè)測(cè)試樣品的端粒重復(fù)序列時(shí)不會(huì)延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度。定量PCR分析的一個(gè)限制在于所選擇的熒光檢測(cè)模式。使用SYBR Green和雙標(biāo)記熒光(Taqman)方法是賊常用的兩種定量PCR方法。佳學(xué)基因開(kāi)發(fā)的原始qPCR端粒長(zhǎng)度方法使用SYBR Green測(cè)量TTAGGG端粒重復(fù)序列的擴(kuò)增中的熒光。佳學(xué)基因解碼開(kāi)發(fā)的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法繼續(xù)使用SYBR Green捕獲端粒重復(fù)序列和單拷貝基因的雙鏈DNA擴(kuò)增,以避免改變兩種qPCR測(cè)定的運(yùn)行條件。SYBR Green比Taqman更便宜,但可能也會(huì)檢測(cè)到端粒區(qū)域的非特異性產(chǎn)物。佳學(xué)基因端?;驒z測(cè)比較了SYBR Green和Taqman方法在四種腺苷受體亞型的實(shí)時(shí)定量PCR分析中的應(yīng)用,并發(fā)現(xiàn)在使用高性能引物和適當(dāng)?shù)膮f(xié)議時(shí),兩種檢測(cè)方法都能產(chǎn)生正確的數(shù)據(jù)。佳學(xué)基因使用的替代IFNB1 qPCR研究通過(guò)在NTC樣品中使用端粒和替代IFNB1單拷貝基因引物來(lái)獲得無(wú)引物二聚體擴(kuò)增并達(dá)到閾值,也提供了良好高效的ICC結(jié)果。因此,佳學(xué)基因檢測(cè)的結(jié)果支持觀察到端粒重復(fù)序列和替代IFNB1單拷貝基因qPCR測(cè)定中有限的非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。佳學(xué)基因檢測(cè)驗(yàn)證了之前的比較研究中顯示的比較IFNB1單拷貝基因所獲得的端粒結(jié)果與使用DNAm端粒長(zhǎng)度方法獲得的結(jié)果之間的不一致性。佳學(xué)基因解決了比較IFNB1單拷貝基因qPCR測(cè)定設(shè)計(jì)問(wèn)題。佳學(xué)基因檢測(cè)提出的替代IFNB1單拷貝基因測(cè)定方法不存在其他基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)存的在的任何問(wèn)題,并顯示出真正的單拷貝基因測(cè)定。任何進(jìn)一步實(shí)施這種替代IFNB1單拷貝基因測(cè)定方法的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定將避免與進(jìn)一步的端粒長(zhǎng)度比較研究存在任何差異,并減少使用不同端粒長(zhǎng)度方法進(jìn)行的不同研究之間的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度結(jié)果的挑戰(zhàn)。

表6. 使用含質(zhì)粒的替代IFNB1(兩步)qPCR方案計(jì)算的端粒長(zhǎng)度。

Sample ID Telomere Ct SD Single Copy Gene Ct SD Relative 端粒長(zhǎng)度 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度
2–ΔCt LN (2–ΔCt) T/S (kbp)
Females (mean)           6.33 5.69
Saliva DNA A 14.61 0 24.54 0.03 975.50 6.88 9.41
Saliva DNA B 15.79 0 25.09 0.08 630.35 6.45 6.05
Saliva DNA C 16.28 0.01 25.30 0.08 519.15 6.25 5.01
Whole Blood DNA C 17.00 0.06 25.83 0.00 455.09 6.12 4.30
Whole Blood DNA B 17.74 0.06 25.35 0.09 390.72 5.97 3.66
Males (mean)           6.48 6.34
Saliva DNA A 15.84 0.03 25.44 0.02 776.05 6.65 7.30
Saliva DNA B 15.88 0.02 24.91 0.01 522.76 6.26 5.05
Saliva DNA C 16.27 0.02 25.63 0.01 657.11 6.49 6.20
Whole Blood DNA C 17.61 0.03 26.35 0.03 427.57 6.06 3.98
Whole Blood DNA B 16.22 0.10 26.20 0.07 1009.90 6.92 9.15
Jurkat DNA (short telomere) 17.45 0.01 26.27 0.02 451.94 6.11 4.22
ΔCt average for standards −3.45   −3.60        
R2 1.00   1.00        
PCR efficiency 0.95   0.90        
表5. 使用含質(zhì)粒的36B4(兩步)qPCR方案計(jì)算端粒長(zhǎng)度
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