【佳學(xué)基因檢測】非小細(xì)胞肺癌生物標(biāo)志物的檢測方法或技術(shù)

什么是質(zhì)譜技術(shù)，如何在肺癌基因檢測中使用？

質(zhì)譜技術(shù)(Mass spectrometry, MS)是一種能夠正確測定未知樣本中的化合物質(zhì)量的技術(shù)。它基于生成帶電荷的離子,并根據(jù)質(zhì)荷比對離子進(jìn)行分離和檢測的原理。

質(zhì)譜技術(shù)在肺癌基因檢測中的應(yīng)用主要有:

蛋白質(zhì)組學(xué)分析:通過質(zhì)譜技術(shù)可以定量檢測細(xì)胞或血液樣本中的大規(guī)模蛋白表達(dá)譜,尋找與肺癌相關(guān)的蛋白生物標(biāo)志物。

代謝組學(xué)分析:檢測肺癌細(xì)胞或體液中的代謝物變化,研究代謝路徑的重編程,尋找代謝生物標(biāo)志物。

基因組學(xué)分析:質(zhì)譜技術(shù)可以進(jìn)行DNA和RNA的正確定量,檢測基因表達(dá)和甲基化水平的變化。

蛋白質(zhì)互作組學(xué):研究蛋白質(zhì)復(fù)合物和相互作用,尋找驅(qū)動肺癌發(fā)生的關(guān)鍵蛋白網(wǎng)絡(luò)。

圖像質(zhì)譜:直接在組織切片上進(jìn)行質(zhì)譜分析,研究腫瘤組織的分子表達(dá)模式。

液體活檢:使用質(zhì)譜技術(shù)分析血液循環(huán)腫瘤DNA、外泌體等樣本,實現(xiàn)檢測。

綜上,質(zhì)譜技術(shù)為肺癌提供了多組學(xué)層面的檢測手段,能提高生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)效率,有助于肺癌的早診早治。未來質(zhì)譜技術(shù)與其他檢測技術(shù)的整合,將大大推動肺癌正確醫(yī)學(xué)的發(fā)展。 質(zhì)譜技術(shù)允許對早期非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行非假設(shè)驅(qū)動的全蛋白分析,該技術(shù)將目的導(dǎo)向的樣本制備與質(zhì)譜前的液相色譜技術(shù)相結(jié)合。它涉及樣本消化、肽段滴定、電離和生物標(biāo)志物表征等。這些包括優(yōu)化樣本制備流程(MStern印跡、免疫耗竭/濾助樣品制備、懸浮捕獲)、改變質(zhì)譜掃描模式(數(shù)據(jù)依賴采集、數(shù)據(jù)獨立采集)、開發(fā)定量技術(shù)(同位素標(biāo)記/無標(biāo)記)和改進(jìn)儀器(離子捕獲質(zhì)譜、高場不對稱離子遷移譜)。使用血液或血清,單次質(zhì)譜運(yùn)行可以表征數(shù)百至數(shù)千個蛋白?；谫|(zhì)譜的液體活檢已在多種癌癥包括非小細(xì)胞肺癌中進(jìn)行。

proximity擴(kuò)展測定的原理及其在腫瘤基因檢測中的應(yīng)用

proximity擴(kuò)展測定(Proximity extension assay, PEA)是一種蛋白檢測技術(shù),基于傳統(tǒng)ELISA方法和DNA測序技術(shù)的原理。

PEA的工作原理是:

使用特異性抗體對標(biāo)定待測蛋白?？贵w上連接有互補(bǔ)的DNA序列。

當(dāng)兩個抗體同時結(jié)合目標(biāo)蛋白時,相連的DNA鏈發(fā)生靠近,觸發(fā)連接反應(yīng)。

連接后的DNA鏈經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測序。

通過測序reads數(shù)計算目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

PEA技術(shù)在腫瘤基因檢測中的應(yīng)用:

可同時定量檢測數(shù)十到數(shù)百種腫瘤相關(guān)蛋白標(biāo)志物。

可用于血液循環(huán)腫瘤DNA等樣本,實現(xiàn)非入侵性檢測。

可通過蛋白組學(xué)檢測實現(xiàn)病情監(jiān)測、藥效評價、預(yù)后預(yù)測等。

結(jié)合腫瘤基因組數(shù)據(jù),可以檢測驅(qū)動基因突變導(dǎo)致的蛋白表達(dá)變化。

可用于研發(fā)與臨床轉(zhuǎn)化,如開發(fā)診斷蛋白組學(xué)檢測試劑盒。

綜上,PEA技術(shù)具有高通量多靶點檢測優(yōu)勢,為腫瘤正確醫(yī)學(xué)提供了重要的蛋白組學(xué)檢測手段。

 proximity擴(kuò)展測定基于傳統(tǒng)夾心ELISA和DNA讀出技術(shù)工作原理。該血清蛋白質(zhì)譜技術(shù)需要極少的樣本量并具有全面的檢測范圍。特異性抗體對通過互補(bǔ)DNA寡核苷酸序列標(biāo)記,允許高保真的差異雜交。所產(chǎn)生的DNA序列經(jīng)擴(kuò)增后進(jìn)行下一代測序。該先進(jìn)的自我擴(kuò)展測定法可檢測3072個靶點,避免了傳統(tǒng)多重免疫分析中的交叉反應(yīng)問題。但是,高通量自我擴(kuò)展測定存在庫構(gòu)建、測序和分析等方面的折衷。
 

反相蛋白質(zhì)數(shù)組與肺癌檢測

反相蛋白質(zhì)數(shù)組(Reverse phase protein array, RPPA)是一種高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),可用于肺癌的檢測。

RPPA技術(shù)原理:

1. 轉(zhuǎn)錄組水平:將腫瘤組織/細(xì)胞裂解,提取總蛋白并打印成點陣列。
2. 抗體檢測:使用經(jīng)驗證的特異性抗體探針,檢測點陣列中的蛋白表達(dá)和翻譯后修飾。
3. 信號檢測:熒光或發(fā)色基質(zhì)反應(yīng)檢測信號。
4. 數(shù)據(jù)分析:相對蛋白表達(dá)水平和修飾情況。

RPPA技術(shù)在肺癌檢測中的應(yīng)用:

1. 可同時檢測數(shù)百種腫瘤相關(guān)蛋白和修飾形式。
2. 可區(qū)分肺癌不同病理類型。
3. 檢測治療響應(yīng)和預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物。
4. 評估腫瘤進(jìn)展和藥物耐藥的分子機(jī)制。
5. 優(yōu)于Western blot,維持組織的空間信息。
6. 可用于血清、血漿等體液樣本。
7. 可打印入微陣列進(jìn)行高通量檢測。

總之,RPPA技術(shù)具備高通量和高特異性的優(yōu)勢,可檢測包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的關(guān)鍵蛋白標(biāo)志物,有助于疾病的正確化檢測試劑盒開發(fā)、病情監(jiān)測以及藥物研發(fā)。

反相蛋白質(zhì)數(shù)組是一種高通量靶向的高通量蛋白質(zhì)譜技術(shù),優(yōu)于組織檢測的蛋白質(zhì)檢測,可檢測蛋白及其翻譯后修飾。有效變性的蛋白質(zhì)固定于稀釋系列的基質(zhì)上。使用高特異性經(jīng)反相蛋白質(zhì)數(shù)組驗證的抗體探針含樣本的切片,并用熒光檢測或顏色顯影進(jìn)行定量信號檢測。利用這種方法可檢測直徑小于100nm的細(xì)胞外囊泡中的腫瘤蛋白標(biāo)志物,可擴(kuò)展至液體活檢。盡管該技術(shù)需要精細(xì)的工作流程,但已經(jīng)應(yīng)用反相蛋白質(zhì)數(shù)組技術(shù)分析了276種細(xì)胞蛋白,發(fā)現(xiàn)了7種乳腺癌蛋白生物標(biāo)志物。

核酸適體與肺癌正確用藥

核酸適體(Aptamer)是一類可以特異性識別目標(biāo)分子的短單鏈DNA或RNA。它可以與蛋白質(zhì)、小分子化合物等靶標(biāo)具有高親和力和專一性的結(jié)合,在肺癌正確用藥中具有潛在應(yīng)用價值。

核酸適體技術(shù)在肺癌正確用藥領(lǐng)域的幾個應(yīng)用:

1. 識別和富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞:適體可以特異性捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞,進(jìn)行檢測和分析。

2. 靶向藥物送遞:通過與腫瘤相關(guān)靶點親和的適體,可以特異性向腫瘤細(xì)胞遞送藥物。

3. 聯(lián)合治療策略優(yōu)化:使用適體識別耐藥相關(guān)分子,指導(dǎo)聯(lián)合用藥策略。

4. 治療反應(yīng)監(jiān)測:設(shè)計特異性適體探針,評估治療反應(yīng)和耐藥過程。

5. 新藥篩選平臺:適體-靶點結(jié)合系統(tǒng)用于verification新藥的靶向性能。

6. 腫瘤成像:使用熒光或放射性標(biāo)記的適體實現(xiàn)腫瘤的輕射線成像。

總之,核酸適體技術(shù)提供了一系列優(yōu)異的生物探針,其高特異性親和力可廣泛應(yīng)用于肺癌的正確診斷與用藥。適體技術(shù)的進(jìn)一步研發(fā),將大大促進(jìn)肺癌正確醫(yī)學(xué)的進(jìn)步。

核酸適體是可以與靶蛋白高親和力和特異性結(jié)合的短單鏈DNA、RNA或肽。慢解離速率適體掃描測定使用連接了熒光標(biāo)記物和光裂解連接基的結(jié)合分子,經(jīng)過生物素 Affinity富集和UV裂解及標(biāo)記后與蛋白質(zhì)復(fù)合。然后蛋白-適體復(fù)合物經(jīng)洗脫,通過DNA雜交技術(shù)進(jìn)行定量。該技術(shù)實現(xiàn)了并行超高通量篩選7000多種蛋白質(zhì),但設(shè)計高質(zhì)量適體用于新靶點的難度仍然存在。

抗原抗體陣列與肺癌正確用藥

抗原抗體陣列技術(shù)利用抗原-抗體特異性結(jié)合原理,可以在固相載體上高通量并行檢測多個蛋白質(zhì)標(biāo)志物,在肺癌正確用藥中有廣闊應(yīng)用前景。

抗原抗體陣列技術(shù)在肺癌正確用藥中的幾個應(yīng)用:

1. 多標(biāo)志物聯(lián)合檢測:實現(xiàn)對數(shù)十到上百腫瘤相關(guān)蛋白的高通量定量,評估整體生物標(biāo)志物譜。

2. 正確分子分類:不同細(xì)胞亞群分子表達(dá)模式的差異,有利于細(xì)胞功能狀態(tài)正確判斷。

3. 藥效預(yù)測:檢測關(guān)鍵通路/過程的蛋白表達(dá)變化,評價靶向藥物療效。

4. 耐藥機(jī)制研究:比較敏感性和耐藥腫瘤的差異蛋白表達(dá),解析獲得性耐藥機(jī)制。

5. 個體化用藥選擇:指導(dǎo)藥物的正確應(yīng)用,實現(xiàn)藥物-患者匹配。

6. 藥效動態(tài)監(jiān)測:不同給藥時間點收集標(biāo)本,監(jiān)測藥物作用過程。

7. 新藥開發(fā)平臺:評價新藥分子的作用方式和適應(yīng)證。

8. 臨床試驗支撐:蛋白組學(xué)分析驗證新藥臨床前后效應(yīng)。

綜上,抗原抗體陣列技術(shù)可實現(xiàn)對肺癌正確診斷和用藥的多維度支持,推動肺癌正確醫(yī)學(xué)實踐。 基于夾心ELISA和磁珠的陣列僅限于中低通量蛋白質(zhì)譜分析?？乖贵w陣列因其在分析和生化特性上的相似性,采用平面和磁珠抗體陣列以及蛋白質(zhì)組陣列。它通過親和力結(jié)合、共價結(jié)合和物理吸附等方式將特定抗體固定在基質(zhì)上。該方法穩(wěn)定性強(qiáng),可以表征成千上萬種蛋白,賊小化免疫反應(yīng)混合液中抗體誘導(dǎo)的免疫原性交叉反應(yīng)?？贵w陣列具有超高靈敏度,可以克服非靶向蛋白引起的交叉敏感問題。理論上,抗原陣列可以檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、細(xì)胞、小分子、脂質(zhì)、抗體和核酸的相互作用。迄今為止,賊全面的人源蛋白質(zhì)組陣列可檢測21000多種蛋白形式(覆蓋超過81%的蛋白質(zhì)組),使其成為強(qiáng)大的工具。此外,高通量蛋白質(zhì)陣列被用來設(shè)計一組針對H-RAS、P53和ETHE1的早期肺癌診斷自身抗體組合診斷面板。